發(fā)布時(shí)間：2017-04-08 00:05

  本文關(guān)鍵詞：吲哚在遲緩愛德華氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)重要的病原菌之一,該菌引發(fā)的疾病已成為山東省鲆鰈魚類養(yǎng)殖的首要病害,并對(duì)當(dāng)?shù)睾ＫB(yǎng)殖業(yè)造成重大損失。近年來(lái),在遲緩愛德華氏菌密度感應(yīng)系統(tǒng)及其相關(guān)致病性的研究中發(fā)現(xiàn)該菌產(chǎn)生大量吲哚堿類物質(zhì),其中以吲哚產(chǎn)生的量最大。目前,吲哚被證實(shí)是細(xì)菌一種新的密度感應(yīng)信號(hào)分子,并參與細(xì)菌的多種生理活動(dòng),如氨基酸代謝、芽孢的產(chǎn)生、質(zhì)粒的穩(wěn)定性、抗藥性、生物膜的形成、毒力、抗酸性等。前期研究發(fā)現(xiàn)吲哚不僅調(diào)控遲緩愛德華氏菌的運(yùn)動(dòng)性、脂多糖產(chǎn)生和耐藥性,而且參與其對(duì)斑馬魚的致病性。Ⅲ型分泌系統(tǒng)為遲緩愛德華氏菌重要的毒力分泌系統(tǒng),有關(guān)吲哚在遲緩愛德華氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及調(diào)控作用的研究至今還未有相關(guān)報(bào)道。本論文在前期研究基礎(chǔ)上,利用overlap-PCR方法構(gòu)建了ΔesrB、ΔtnaAΔesrB、 ΔcpxR、AbaeR和AtnaAAcpxR突變株,并結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real timePCR)以及斑馬魚人工感染等實(shí)驗(yàn)方法,探究了在遲緩愛德華氏菌中吲哚對(duì)Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)、對(duì)BaeSR和CpxAR雙組份調(diào)控系統(tǒng)、對(duì)斑馬魚致病力和對(duì)耐酸性的影響,以及吲哚與rpos基因的相互作用關(guān)系。在吲哚對(duì)遲緩愛德華氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)的影響研究中,發(fā)現(xiàn)除了基因escB、escC、eseB和eseD外,其它Ⅲ型分泌系統(tǒng)的相關(guān)基因(esaC、escA、 eseC、eseE、eseG、esrA、esrB和esrC)均顯著受到色氨酸酶編碼基因(tnaA)的正向調(diào)控,其中吲哚對(duì)于調(diào)節(jié)蛋白基因esrB的調(diào)控作用最大(約32倍)。吲哚可通過esrB調(diào)控Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá),但esrB并不是吲哚信號(hào)傳遞的唯一途徑。吲哚對(duì)Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)的影響呈濃度依賴型,吲哚濃度為30μM(遲緩愛德華氏菌自身產(chǎn)吲哚的最大生理濃度為35.5μM)時(shí),Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量最大。還發(fā)現(xiàn)與Ⅲ型分泌系統(tǒng)具有密切聯(lián)系的PhoP-PhoQ雙組分系統(tǒng)并不受吲哚的調(diào)控。在吲哚對(duì)遲緩愛德華氏菌BaeSR和CpxAR雙組份調(diào)控系統(tǒng)及致病力的影響研究中,發(fā)現(xiàn)吲哚還對(duì)對(duì)BaeSR和CpxAR雙組份調(diào)控系統(tǒng)具有正向調(diào)控作用；雙組份調(diào)控系統(tǒng)CpxAR是吲哚參與對(duì)Ⅲ型分泌系統(tǒng)調(diào)控的一個(gè)重要節(jié)點(diǎn),吲哚還可以通過其他旁路途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)Ⅲ型分泌系統(tǒng)的調(diào)控,而BaeAR雙組份調(diào)控系統(tǒng)不參與吲哚對(duì)Ⅲ型分泌系統(tǒng)的調(diào)控。吲哚僅是雙組份調(diào)控系統(tǒng)CpxAR調(diào)控Ⅲ型分泌系統(tǒng)的重要信號(hào)分子之一。通過斑馬魚人工感染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),除ΔbaeR突變株外,其它突變株(ΔesrB、ΔcpxR、ΔtnaAΔcpxR、ΔtnaAΔesrB)均顯著提高斑馬魚的存活率,進(jìn)一步驗(yàn)證吲哚可以通過CpxAR雙組分調(diào)控系統(tǒng)和Ⅲ型分泌系統(tǒng)參與毒力的調(diào)控。在吲哚與遲緩愛德華氏菌rpos基因的相互作用關(guān)系研究中,發(fā)現(xiàn)低劑量的羧芐青霉素(Carbenicillin),促進(jìn)遲緩愛德華氏菌產(chǎn)生更多的吲哚,并顯著抑制rpos基因的表達(dá)。而且發(fā)現(xiàn)rpos促進(jìn)吲哚的產(chǎn)生,同時(shí)吲哚會(huì)反向抑制rpos的表達(dá)。在吲哚對(duì)遲緩愛德華氏菌耐酸性的影響研究中,發(fā)現(xiàn)當(dāng)tnaA缺失,遲緩愛德華氏菌無(wú)法產(chǎn)生吲哚后,細(xì)菌的耐酸性顯著提高,吲哚對(duì)于遲緩愛德華氏菌耐酸性具有抑制作用。研究吲哚在遲緩愛德華氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)中的信號(hào)傳遞途徑以及對(duì)Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因的調(diào)控作用,有助于全面認(rèn)識(shí)吲哚在遲緩愛德華氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)以及毒力調(diào)控中的重要性,促進(jìn)對(duì)遲緩愛德華氏菌致病機(jī)制的深入理解,為今后研發(fā)環(huán)境友好型的病害防治方法提供新的思路。
【關(guān)鍵詞】：吲哚 遲緩愛德華氏菌 Ⅲ型分泌系統(tǒng) rpos 耐酸性 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 致病性
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S941.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-27
• 1 前言13
• 2 遲緩愛德華氏菌的研究進(jìn)展13-20
• 2.1 分類地位和生物學(xué)特性13
• 2.2 宿主種類和疾病流行特征13-14
• 2.3 全基因組信息14
• 2.4 遲緩愛德華氏菌的致病機(jī)制14-20
• 2.4.1 黏附和侵入14-15
• 2.4.2 抵抗宿主免疫機(jī)制15
• 2.4.3 從宿主內(nèi)攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)15
• 2.4.4 分泌毒素和酶類15-16
• 2.4.5 分泌系統(tǒng)16-19
• 2.4.6 細(xì)胞內(nèi)寄生特性19-20
• 2.4.7 菌體表面與毒力相關(guān)的結(jié)構(gòu)20
• 2.4.8 密度感應(yīng)(quorum sensing,QS)20
• 3 吲哚作為細(xì)菌細(xì)胞間信號(hào)分子的研究進(jìn)展20-25
• 3.1 吲哚的生物合成20-21
• 3.2 吲哚參與細(xì)菌多種生理活動(dòng)的調(diào)控21-25
• 3.2.1 吲哚提高細(xì)菌耐藥性22
• 3.2.2 吲哚參與病原菌毒力調(diào)控22-23
• 3.2.3 吲哚參與細(xì)菌生物膜形成23-24
• 3.2.4 吲哚參與細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性調(diào)控24
• 3.2.5 吲哚參與細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)24
• 3.2.6 吲哚提高細(xì)菌質(zhì)粒的穩(wěn)定性24-25
• 3.2.7 吲哚參與細(xì)菌耐酸性調(diào)控25
• 3.2.8 吲哚參與孢子的形成25
• 4 本論文研究的目的和意義25-27
• 第二章 吲哚對(duì)遲緩愛德華氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)的影響27-50
• 1 摘要27
• 2 實(shí)驗(yàn)材料27-30
• 2.1 實(shí)驗(yàn)菌株及質(zhì)粒27-28
• 2.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法28
• 2.3 實(shí)驗(yàn)試劑28-29
• 2.4 主要溶液和試劑的配制29
• 2.5 實(shí)驗(yàn)儀器29-30
• 3 實(shí)驗(yàn)方法30-42
• 3.1 確定受吲哚調(diào)控的遲緩愛德華氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因30-32
• 3.2 吲哚濃度對(duì)遲緩愛德華氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)的影響32-33
• 3.3 △esrB和△tnaA△esrB突變株的構(gòu)建及篩選33-40
• 3.4 確定受esrB調(diào)控的遲緩愛德華氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的相關(guān)基因40-41
• 3.5 吲哚濃度對(duì)受esrB調(diào)控的Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)的影響41
• 3.6 研究吲哚對(duì)遲緩愛德華氏菌phop基因表達(dá)的影響41-42
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析42-48
• 4.1 △esrB和△tnaA△esrB突變株的構(gòu)建42-44
• 4.2 確定受吲哚調(diào)控的遲緩愛德華氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因44-45
• 4.3 吲哚濃度對(duì)遲緩愛德華氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)的影響45-46
• 4.4 受esrB調(diào)控的遲緩愛德華氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因的確定46
• 4.5 吲哚濃度對(duì)受esrB調(diào)控的Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)的影響46-48
• 4.6 研究吲哚對(duì)遲緩愛德華氏菌phop基因表達(dá)的影響48
• 5 討論48-50
• 第三章 吲哚對(duì)遲緩愛德華氏菌BaeSR和CpxAR雙組份調(diào)控系統(tǒng)及致病力的影響50-62
• 1 摘要50
• 2 實(shí)驗(yàn)材料50-51
• 2.1 實(shí)驗(yàn)菌株及質(zhì)粒50
• 2.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法50
• 2.3 實(shí)驗(yàn)試劑和溶液配制50-51
• 2.4 實(shí)驗(yàn)儀器51
• 2.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物51
• 3 實(shí)驗(yàn)方法51-55
• 3.1 △cpxR、△baeR和△tnaA△cpxR突變株的構(gòu)建及篩選51-53
• 3.2 確定遲緩愛德華氏菌cpxR和baeR基因的表達(dá)受吲哚影響53
• 3.3 吲哚濃度影響△tnaA突變株cpxR和baeR基因的表達(dá)53-54
• 3.4 受cpxR和baeR調(diào)控的遲緩愛德華氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因的確定54
• 3.5 吲哚濃度對(duì)△tnaA△cpxR突變株Ⅲ型分泌系統(tǒng)基因表達(dá)的影響54-55
• 3.6 遲緩愛德華氏菌△tnaA、△esrB、△cpxR、△baeR、△tnaA△esrB、△tnaA△cpxR突變株對(duì)斑馬魚致病性的研究55
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析55-60
• 4.1 確定遲緩愛德華氏菌cpxR和baeR基因的表達(dá)受吲哚影響55-56
• 4.2 吲哚濃度影響△tnaA突變株cpxR和baeR基因的表達(dá)56
• 4.3 受cpxR調(diào)控的遲緩愛德華氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因的確定56-58
• 4.4 吲哚濃度對(duì)△tnaA△cpxR突變株Ⅲ型分泌系統(tǒng)基因表達(dá)的影響58-59
• 4.5 baeR不參與遲緩愛德華氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因的調(diào)控59
• 4.6 遲緩愛德華氏菌△tnaA、△esrB、△cpxR、△baeR、△tnaA△esrB、△tnaA△cpxR突變株對(duì)斑馬魚致病性的研究59-60
• 5 討論60-62
• 第四章 吲哚與遲緩愛德華氏菌rpos基因的相互作用關(guān)系62-73
• 1 摘要62
• 2 實(shí)驗(yàn)材料62-63
• 2.1 實(shí)驗(yàn)菌株及質(zhì)粒62
• 2.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法62
• 2.3 實(shí)驗(yàn)試劑和溶液配制62-63
• 2.4 實(shí)驗(yàn)儀器63
• 3 實(shí)驗(yàn)方法63-67
• 3.1 研究吲哚對(duì)遲緩愛德華氏菌rpos基因表達(dá)的影響63-65
• 3.2 研究rpos對(duì)遲緩愛德華氏菌吲哚產(chǎn)生的影響65-67
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析67-71
• 4.1 研究吲哚對(duì)遲緩愛德華氏菌rpos基因表達(dá)的影響67-70
• 4.2 研究rpos對(duì)遲緩愛德華氏菌吲哚產(chǎn)生的影響70-71
• 5 討論71-73
• 第五章 吲哚對(duì)遲緩愛德華氏菌耐酸性的影響73-79
• 1 摘要73
• 2 實(shí)驗(yàn)材料73-74
• 2.1 實(shí)驗(yàn)菌株及質(zhì)粒73
• 2.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法73
• 2.3 實(shí)驗(yàn)試劑73
• 2.4 實(shí)驗(yàn)儀器73-74
• 3 實(shí)驗(yàn)方法74-75
• 3.1 研究吲哚對(duì)遲緩愛德華氏菌耐酸基因表達(dá)的影響74-75
• 3.2 研究吲哚對(duì)遲緩愛德華氏菌耐酸性的影響75
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析75-77
• 4.1 研究吲哚對(duì)遲緩愛德華氏菌耐酸基因表達(dá)的影響75-76
• 4.2 低pH梯度對(duì)遲緩愛德華氏菌野生株LTB-4和△tnaA突變株生長(zhǎng)的影響76-77
• 5 討論77-79
• 全文總結(jié)79-81
• 參考文獻(xiàn)81-89
• 致謝89-90
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷90
• 發(fā)表和撰寫的文章90

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3 潘延樂;洶愛德華氏菌ompN基因的克隆及其原核表達(dá)產(chǎn)物對(duì)斑點(diǎn)叉尾洶的保護(hù)效果評(píng)價(jià)[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

4 郭欣;南方鲇愛德華氏菌的分離鑒定及雙重PCR診斷方法的建立[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

5 孫苗苗;吲哚在遲緩愛德華氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2015年

6 邵帥;愛德華氏菌基因組測(cè)序及進(jìn)化分析[D];華東理工大學(xué);2014年

7 張曉佩;遲緩愛德華氏菌鞭毛蛋白的研究[D];福建師范大學(xué);2008年

8 蘭建新;養(yǎng)殖大菱鲆病原菌遲緩愛德華氏菌的分離鑒定及快速檢測(cè)技術(shù)的建立[D];中國(guó)海洋大學(xué);2008年

9 王榮華;洶愛德華氏菌（Edwardsiella ictaluri）菌蛻疫苗的研究[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

10 杜萌;幾種常見致病菌的活的非可培養(yǎng)狀態(tài)研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2007年

  本文關(guān)鍵詞：吲哚在遲緩愛德華氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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