黑果枸杞為重要的生態(tài)經(jīng)濟型多棘刺灌木,其無刺類型更易做經(jīng)濟型林木栽培。本研究通過植物組織培養(yǎng)、盆栽稱重控水、掃描電鏡(SEM)觀察、高通量轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)、實時熒光定量PCR(qRT-PCR)和高效液相色譜(HPLC)等方法,研究黑果枸杞枝刺發(fā)生規(guī)律并探索可能影響其枝刺發(fā)生的因素。主要研究結(jié)果如下:(1)黑果枸杞花苞外植體采用75%酒精處理45 s聯(lián)合0.1%HgCl_2處理3 min時,殺菌效果最好;以MS為基本培養(yǎng)基,添加6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L時,外植體的再生效果最好;以1/2 MS為基本培養(yǎng)基,添加0.2 mg/L IBA時最適合根誘導(dǎo),生根率可達(dá)100%;以篩選出的再生效果最好的培養(yǎng)基作為外植體解除玻璃化的基本培養(yǎng)基,接種于添加40μM AgNO_3培養(yǎng)基中的芽叢脫玻璃化率最高。(2)同一無性系的黑果枸杞植株,田間持水量在80%以上可以表現(xiàn)為整株無枝刺,在60%以下均發(fā)育出枝刺。利用SEM對黑果枸杞的無刺及有刺材料進(jìn)行觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn),黑果枸杞的刺起源于葉腋處的腋生分生組織,表明黑果枸杞的刺為枝刺,同時確定其枝刺發(fā)育的3個時期(無刺期、刺啟動期和刺形成期)。為后續(xù)試驗樣品的采集奠定了基礎(chǔ)。本試驗同時發(fā)現(xiàn)了黑果枸杞的葉原基、葉片和包刺葉狀結(jié)構(gòu)表面有功能未知的柱狀凸起。(3)對無刺期(CK)、刺啟動期(Init)和刺形成期(Form)的黑果枸杞短莖節(jié)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,共產(chǎn)生Clean Data 62.33 Gb,拼接出Unigenes52 816條,注釋到七大功能數(shù)據(jù)庫上的Unigenes總數(shù)為32 000個,占總Unigenes的60.59%。分析發(fā)現(xiàn)CK與Init之間有1 208個DEGs,主要顯著富集在氧化還原活性、S-甲基轉(zhuǎn)移酶活性等GO條目以及類黃酮生物合成KEGG路徑。Init與Form之間有2 828個DEGs,主要富集在氧化還原活性、氧化還原進(jìn)程等GO條目以及植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)KEGG路徑。這兩組比較的DEGs共同顯著富集的GO條目有74個,共同顯著富集到的KEGG路徑有5個,分別為植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑、苯丙氨酸生物合成路徑、類黃酮生物合成路徑、苯丙氨酸代謝路徑和植物晝夜節(jié)律。此外,我們關(guān)注到Init和Form之間的DEGs顯著富集在淀粉和蔗糖代謝KEGG路徑,CK與Init之間的DEGs有3個注釋到該KEGG路徑。該KEGG路徑有一DEG(蔗糖合酶基因)在刺啟動期呈現(xiàn)顯著性低表達(dá);HPLC測定顯示蔗糖含量在刺啟動期極顯著低于無刺期和刺形成期。三種材料蔗糖合酶基因表達(dá)與蔗糖含量呈極顯著正相關(guān),與葡萄糖含量呈極顯著負(fù)相關(guān)。參照植物側(cè)枝發(fā)育的相關(guān)研究結(jié)果,我們推測淀粉和蔗糖代謝KEGG路徑與黑果枸杞枝刺發(fā)生相關(guān),蔗糖為調(diào)控黑果枸杞枝刺發(fā)生的信號,葡萄糖為枝刺發(fā)生提供能量,蔗糖合酶參與蔗糖對枝刺發(fā)生的調(diào)控。本研究為揭示黑果枸杞枝刺發(fā)生機理及培育無刺黑果枸杞品種奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：S567.19
【部分圖文】：

第二章黑果枸杞離體快繁體系的建立18表2-1不同消毒處理的平均污染率及死亡率統(tǒng)計Table2-1Statisticsofaveragepollutionrateanddeadrateofdifferentdisinfectiontreatments注：方差分析采用LSD法；字母a代表顯著性分析結(jié)果（P<0.05）圖2-1黑果枸杞的組織培養(yǎng)及移栽馴化Fig.2-1PlanttissuecultureandtransplantingofL.ruthenicumA.接種的幼花苞外植體；B.培養(yǎng)8d時花冠和子房外植體切口處均開始產(chǎn)生黃白色疏松愈傷組織；C.培養(yǎng)30d觀察到的疏松愈傷組織；D.愈傷組織出現(xiàn)大量芽點并發(fā)生玻璃化現(xiàn)象；E.愈傷組織再分化形成大量芽叢；F.莖段外植體產(chǎn)生芽叢并誘導(dǎo)生根；G.用于移栽的組培苗；H.經(jīng)煉苗并成活的組培植株。A.Inoculatedyoungflowerbudexplants;B.Atthe8thdayofthePlantTissueCulture,yellow-whiteloosecallusbegantoappearattheincisionofcorollaandovaryexplants;C.Loosecallusobservedafter30daysofthePlantTissueCulture;D.Greenbudswereproducedonthecallusandhyperhydricitionoccurred;E.Callusredifferentiationandbudsformation;F.Stemexplantsproducedbudsandinducderootformation;G.Plantletsafteracclimatization;H.Plantletsaftertransplantation.酒精處理時間（s）氯化汞處理時間（min）污染率（%）死亡率（%）污染率+死亡率（%）30232.50±9.55ab0.00±0.00b32.50±9.55a45253.06±13.17a0.00±0.00b53.06±13.17a3030.00±0.00b39.38±8.89a39.38±8.89a4530.00±0.00b25.71±10.43a25.71±10.43a30421.77±4.80ab36.70±4.11a58.47±7.04a45428.54±5.92ab7.69±1.60b36.23±5.52aACDFGHBE

沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文192.2.2以幼葉片和莖段為外植體的組織培養(yǎng)根據(jù)觀察，在接種19d時，以葉片為外植體的部分長出大量叢生幼芽；接種23d，葉片為外植體的部分長出的幼芽逐漸變?yōu)榫G色并且伸長，葉片外植體的脫分化率100%，再分化率為91.67%，接種30d，平均每塊外植體出芽9.62個；接種25d，莖外植體開始產(chǎn)生芽，莖外植體的脫分化率為100%，再分化率為83.33%，接種30d，平均每塊外植體發(fā)芽5個。其中以葉片為外植體產(chǎn)生的芽叢52%出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，以莖為外植體的材料沒有產(chǎn)生玻璃化現(xiàn)象。2.2.3利用AgNO3解除芽叢玻璃化帶有玻璃化芽叢的愈傷組織置于透氣良好的無菌空瓶中，16-50d材料表面干燥，干燥所需時間取決于材料本身的大小，材料越小干燥所需要的時間越短，材料越大干燥所需要的時間越長。由表2-2可知，接種于添加40μM的AgNO3培養(yǎng)基中的外植體脫玻璃化率最高（42.13%），這種處理的培養(yǎng)基最有利于黑果枸杞玻璃化現(xiàn)象的解除。接種于不添加AgNO3培養(yǎng)基中的外植體脫玻璃化率最低（3.93%）。進(jìn)行方差分析后可知，5種培養(yǎng)基中外植體的脫玻璃化率沒有顯著差異。初步推測40μMAgNO3去玻璃化效果較好，今后需要擴大樣本并提高AgNO3濃度繼續(xù)研究。圖2-2饑餓干燥后培養(yǎng)基添加AgNO3對黑果枸杞芽體去玻璃化的影響Fig.2-2TheeffectofAgNO3onthedehyperhydricitionofL.ruthenicumbudafterdried2.3討論利用成熟野外黑果枸杞的幼嫩花苞、組培瓶內(nèi)無菌苗葉片和莖段為外植體，我們建立了高效可重復(fù)的再生體系。組織培養(yǎng)過程中植物材料的污染問題是一大難題，消毒時間過短導(dǎo)致消毒不徹底進(jìn)而導(dǎo)致菌類微生物大量繁殖，消毒時間過長會對殺死外植體的組織細(xì)胞，并影響外植體的存活率。因此，選擇的合適的消毒處理方法對外植體表面進(jìn)

第三章黑果枸杞枝刺發(fā)生機理研究22第三章黑果枸杞枝刺發(fā)生機理研究3.1黑果枸杞不同發(fā)育時期枝刺的形態(tài)特征觀察黑果枸杞屬多棘刺灌木，具有很高的經(jīng)濟價值。但由于其植株密被大量棘刺，嚴(yán)重影響了人工采摘的便捷、效率和品質(zhì)。黑果枸杞的棘刺始終發(fā)生在其葉腋處，不易折斷或剝離，即使強行折斷，斷面也很不完整。目前，國內(nèi)外關(guān)于黑果枸杞的研究主要以對果實成分的分析和其保健功效的研究為主，對其枝刺形成機理的研究未見報道。本試驗通過掃描電鏡下觀察，對不同發(fā)育時期的黑果枸杞腋芽和枝刺進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，為后續(xù)試驗奠定基矗3.1.1試驗材料選取黑果枸杞莖外植體再生的同一組培無性系作為試驗材料。材料移栽之后進(jìn)行盆栽控水,每隔15d澆灌一次霍格蘭（Hogland）營養(yǎng)液，分別獲得無刺（圖3-1-1-A）和有刺植株（圖3-1-1-B）（遺傳背景一致）。田間持水量在80%以上時，黑果枸杞植株整莖沒有任何肉眼可見刺狀結(jié)構(gòu)；田間持水量在60%以下時，黑果枸杞植株每個莖僅最上端2-3個葉腋處無刺，其余均有刺，且枝刺從上到下呈現(xiàn)逐漸延長變硬的趨勢，隨著發(fā)育的進(jìn)行，上端無刺葉腋也會依次出現(xiàn)枝刺。從無刺植株取3個條枝，每條枝上取除頂芽后從上到下的6個莖節(jié)作為材料；從有刺植株取3個枝條，每條枝上取除頂芽后從上到下的6個莖節(jié)為材料。圖3-1-1黑果枸杞的無刺植株莖（A）和有刺植株莖（B）Fig.3-1-1Stemsofthornless(A)andthornyL.ruthenicum(B)3.1.2試驗方法AB
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2893020