磷是植物生長發(fā)育所需的大量元素,在植物的生命活動中發(fā)揮重要作用,磷缺乏將嚴重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。由于作為磷肥主要來源的磷礦石資源的匱乏和趨于耗竭,缺磷已成為未來世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個巨大挑戰(zhàn)。利用轉基因技術調控磷效率相關基因的表達,培育磷高效作物新品種,可有效地解決上述問題。選擇合適的啟動子可以促進轉基因的有效表達,有利于轉基因技術的成功應用。因此,克隆可用于磷效率育種的啟動子具有重要意義。ZmPht1;5編碼一個高親和磷轉運體蛋白,具有吸收和轉運磷的能力以及磷饑餓響應特性,但其啟動子序列一直未被克隆和研究,其潛在的調控網(wǎng)絡尚不明確。本研究從玉米中克隆了 ZmPht1;5基因ATG上游的1895 bp序列(M2P-1),構建了系列5’端缺失突變體(M2P-2～M2P-8),對其進行了系統(tǒng)的功能鑒定。M2P-1～M2P-8在煙草中的組織表達模式分析表明,其萌發(fā)2、7、14和21天的小苗,培養(yǎng)至60天及90天植株的根、莖、葉和生長90天植株的種子、果實和花中均能驅動GUS表達,但它們的表達活性存在明顯差異,其中M2P-7(-259 bp～-1 bp)的活性最高,在正常條件下可達到CaMV35S啟動子的1.5倍左右,表明M2P-7片段可能是ZmPht1;5高強度表達的關鍵序列。為了明確啟動子PZmPht1;5及其5’端缺失片段的磷饑餓響應能力,我們以WT和CaMV35S轉基因煙草分別作為陰性和陽性對照,對15日齡的M2P-1～M2P-8突變體煙草及對照進行了低磷脅迫(10μM KH2PO4)處理實驗。GUS染色和酶活測定結果顯示,隨著植物體內可溶性磷濃度的降低,M2P-1～M2P-8的啟動子活性相應增強,而CaMV35S的啟動子活性在低磷處理前后無顯著差異。值得注意的是在低磷處理至第9天時,M2P-7在根、莖和葉中的啟動子活性分別達到了CaMV35S啟動子的3.5、4.0和3.3倍。以上結果表明,M2P-7可在低磷條件下驅動目的基因高強度表達,在雙子葉作物磷高效轉基因育種中具有重要應用價值。為了進一步評估M2P-7在單子葉植物遺傳轉化中的應用潛質,我們分別將M2P-7和玉米Ubi-1啟動子(陽性對照)連入pCAMBIA1391Z載體中,驅動GUS的表達,并導入玉米自交系Qi319中。GUS組織化學染色和酶活測定結果顯示,在萌發(fā)3天的種子胚根、7天和14天小苗的根、莖和葉中,M2P-7較Ubi-1似乎具有更高的啟動子活性。為了明確M2P-7在玉米中是否依然具有磷饑餓響應特性,我們對M2P-7和pCAMBIA1391Z-Ubi-GUS(陽性對照)轉基因小苗進行了低磷脅迫(5μM KH2PO4)處理實驗。GUS組織化學染色和酶活測定結果顯示,在低磷處理至第7天和第10天時M2P-7在玉米根、莖和葉中的表達活性比足磷條件下提高了約1.3倍,而Ubi-1啟動子在低磷處理前后無顯著差異。值得注意的是,盡管M2P-7在玉米中的磷饑餓誘導能力相對較低,但在低磷條件下M2P-7在所有檢測的組織中的啟動子活性均顯著高于Ubi-1啟動子,預示著M2P-7在單子葉植物磷高效育種中也具有很好的應用潛質。總之,本工作通過對ZmPht1;5啟動子進行5’系列缺失突變體的構建、組織表達模式及磷饑餓響應特性分析,發(fā)現(xiàn)長度為295-bp的M2P-7片段是該啟動子的核心功能序列,具有高的啟動子活性和一定的低磷誘導特性。在低磷脅迫條件下,M2P-7的啟動子活性在煙草中可達到雙子葉植物轉化中最常用的CaMV35S啟動子的3倍以上,在玉米中可達到單子葉作物育種中最常用的玉米Ubi-1啟動子的大約1.3倍,在單子葉和雙子葉作物磷高效轉基因育種中均體現(xiàn)出了很高的應用潛質。上述研究結果不僅可加深我們對ZmPht1;5基因低磷脅迫響應特性及其表達調控機制的了解,而且為作物基因工程育種提供了可供選擇的啟動子資源。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2020
【中圖分類】：S513
【部分圖文】：

?山東大學碩士學位論文???３．４?Ｍ２Ｐ－１－Ｍ２Ｐ－８轉基因本生煙草的獲得??將Ｍ２Ｐ－１?￣Ｍ２Ｐ－８質粒以及驅動Ｇｔ／Ｓ表達的質粒（ｐＣＡＭＢＩＡ?１３０４Ｚ；??陽性對照）利用農(nóng)桿菌介導的葉盤轉化法分別轉入本生煙草，轉化實驗流程見圖??４。??ａ?ｂ?＇?ｃ??＃ｉ＞；??圖４農(nóng)桿菌介導的煙草葉盤轉化流程??ａ，用于轉化的本生煙草；ｂ，農(nóng)桿菌侵染后避光共培養(yǎng)的葉盤；ｃ，在篩選培養(yǎng)基（含１５ｍｇ／Ｌ??潮霉素＋４００?ｍｇ／Ｌ頭孢）上篩選：ｄ，抗性愈傷分化生苗：ｅ，小苗移入Ａ５培養(yǎng)基生根；ｆ，??移栽至育苗土的小苗。??ＣＴＡＢ法提取轉化煙草植株的葉片基因組ＤＮＡ，利用引物ＧＵＳ－Ｆ／Ｒ?（表１）??進行ＰＣＲ擴增（圖５ａ）。ＰＣＲ陽性的植株進一步進行ＧＵＳ染色鑒定（圖５ｂ），??兩者均為陽性的植株用于收獲后代種子。通過潮霉素抗性篩選分離比為３：?１的??Ｔ１代轉基因株系再進行后代繁殖（圖６）。最后，通過分離比統(tǒng)計選擇Ｔ３代單??拷貝純合轉基因品系用于后續(xù)功能分析。Ｍ２Ｐ－ＫＭ２Ｐ－８分別獲得了?４個以上來??自獨立轉化事件的轉基因純合株系。因為本實驗中來自同一個轉化結構的不同純??合株系間的ＧＯＳ表達水平差異并不明顯，所以后續(xù)實驗我們在每個轉化結構中??隨機性地挑選了?３個不同的純合子株系作為實驗材料。??３１??

?山東大學碩士學位論文???Ｉｄ，泰??￥?方零？?＊｜＾ｐｒ??Ｎｅｇａｔｉｖｅ?Ｃｏｎｔｒｏｌ?（ＷＴ）?Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ?Ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ?Ｒａｔｉｏ?３：１?Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ?Ｌｉｎｅ?Ｐｏｓｔｉｖｅ?Ｃｏｎｔｒｏｌ??圖６轉基因煙草Ｔ１代的單拷貝株系篩選??通過潮霉素抗性篩選分離比為３：?１的Ｔ１代轉基因株系。??３．５正常條件下５及其５’端缺失突變體在轉基因煙草中的??表達模式??為了明確正常條件下Ｍ２Ｐ－１？Ｍ２Ｐ－８及ＣａＭＦ３５＾啟動子在煙草中的表達模??式，我們對萌發(fā)２、７、１４和２１天的轉基因煙草，生長６０和９０天的植株的根、??莖和葉，以及生長９０天植株的種子、花和果實進行了?ＧＵＳ染色（圖７ａ）。ＧＵＳ??染色結果表明，Ｍ２Ｐ－ｌ￣Ｍ２Ｐ－８和啟動子均可實現(xiàn)Ｇｔ／Ｓ在轉基因煙草??中表達，但它們在ＧＵＳ染色強度上存在較大差異。Ｍ２Ｐ－１?（全長啟動子）的ＧＵＳ??染色強度在所有供試組織中最弱，在萌發(fā)２、７、１４和２１天的轉基因幼苗的葉和??根中幾乎無法檢測到ＧＵＳ染色。值得注意的是，位于Ｍ２Ｐ－１－Ｍ２Ｐ－７之間的１６００??ｂｐ?（－１８９５—２９５?ｂｐ）片段的缺失導致Ｍ２Ｐ－７植株在各個組織的ＧＵＳ染色強度似??乎高于Ｍ２Ｐ－１？Ｍ２Ｐ－６、Ｍ２Ｐ－８和Ｑ７ＭＢ５Ｓ啟動子轉基因植株。為了進一步評估??Ｍ２Ｐ１－Ｍ２Ｐ－８和啟動子之間表達強度的差異，我們測定了生長６０天??的轉基因煙草植株的根、莖和葉中的ＧＵＳ酶活（圖７ｂ）。結果顯示，隨著５’側??翼片段的不斷縮短，缺失突變體的啟動子活性逐漸增加，在縮短到２９５ｂｐ（Ｍ２Ｐ－??７）時達到最高，然而在位于Ｍ２Ｐ－７？Ｍ

?山東大學碩士學位論文???果表明，磷饑餓抑制了轉基因煙草植株的生長。??ａ?０?ｄ?３?ｄ?６ｄ?９?ｄ??ｎｒｉｍｔ?Ｊ??＇＾３?０．１５??Ｃ?〇．６１??〇．ｇ?－??ｍｍｍｍ?４?Ｐ?Ａ?＋?Ｐ?＋?Ｐ??Ｃ＝３?－?Ｐ?ｒ?ｆｔ?？?＝?－?Ｐ?？＝?＊?Ｐ??０．１２?ｒｈ?０５?！?＝〇６??ｉＥ』ｔ?Ｌ：：』ｌ??ｐ?ｊＦ?２??＾?０Ｊ？??ｚ??０＾７??－?０．４????—Ｐ?％?＋?Ｉ＊?Ｉ?＋?ｐ??－ｌｄ?６ｄ?９ｄ?３ｄ?６ｄ?９ｄ?３ｄ?６ｄ?９ｄ??圖８低磷處理對煙草植株磷濃度和生長發(fā)育的影響??ａ，轉基因煙草植株的表型；ｂ－ｄ，根、地上部分和整個植株的生物量；ｅ，根冠比；ｆ－ｇ，根和??地上部分可溶性磷濃度。測定數(shù)據(jù)為３次重復的平均值±標準差，每個株系３棵植株，＊代表??低磷處理前后的實驗數(shù)據(jù)達到顯著差異水平（Ｐ＜０．０５，?ｆ檢驗）。??為了明確５及其５’端缺失片段是否對磷饑餓有響應，我們在低磷??處理的第３、６和９天，通過ＧＵＳ組織化學染色和酶活定量分析，測定了?Ｍ２Ｐ－??１－Ｍ２Ｐ－８和啟動子（陽性對照）轉基因煙草幼苗的根、莖和葉中的ＧＵＳ??活性（圖９和圖１０）。結果顯示，隨著轉基因植物體內可溶性磷濃度的降低，Ｍ２Ｐ－??ｌ￣Ｍ２Ｐ－８的啟動子活性相應增強。在低磷處理至第６天和第９天時，Ｍ２Ｐ－１？Ｍ２Ｐ－??８轉基因煙草的ＧＵＳ活性是足磷對照的２倍左右，而啟動子在低磷處??理前后的ＧＵＳ活性無明顯差異（圖１０ｂ？ｃ）。值得注意的是，在缺磷條件下，Ｍ２Ｐ－??３６??
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本文編號：2892013