鹽脅迫嚴(yán)重影響菊花的生長(zhǎng)與生產(chǎn),因此挖掘響應(yīng)鹽脅迫關(guān)鍵基因顯得尤為重要。本研究試驗(yàn)材料選用菊花‘神馬’(Chrysanthemum moliflium‘Jinba’),選定合適的處理時(shí)間和濃度后,對(duì)正常培養(yǎng)和鹽脅迫下的菊花根系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,篩選重要通路及相關(guān)差異表達(dá)基因,利用qRT-PCR驗(yàn)證候選基因的表達(dá),同時(shí),測(cè)定鹽脅迫前后菊花根系的離子含量,滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量,抗氧化酶活性等生理指標(biāo)的變化。主要研究結(jié)論如下:1、分別用100、200、300 mM NaCl處理0、3、6、12、24、36、48 h后,測(cè)定菊花葉片電導(dǎo)率、丙二醛含量、葉綠素含量和根系活力的變化。結(jié)果表明,在100 mM鹽處理下,各項(xiàng)指標(biāo)的變化與對(duì)照組相差不大;在300 mM鹽處理下,各項(xiàng)指標(biāo)均表現(xiàn)顯著上升或下降的趨勢(shì);而在200 mM鹽處理下,尤其處理24 h變化顯著,我們推測(cè)菊花利用體內(nèi)的調(diào)節(jié)機(jī)制適應(yīng)脅迫環(huán)境,由此確定了24 h和200 mM為轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的合適值。2、利用Illumina Hiseq測(cè)序平臺(tái)對(duì)菊花根系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,創(chuàng)建了6個(gè)cDNA文庫(kù)(CK1、CK2、CK3、SS1、SS2、SS3)。共獲得大約68.30 Gb有效序列,經(jīng)從頭組裝得到70,764個(gè)unigenes,并與公共數(shù)據(jù)庫(kù)TrEMBL、NR、Pfam、KOG、GO和KEGG比對(duì)得到基因注釋,幾乎涵蓋了所有的功能和代謝通路。以|log2(fold change)|1且P值≤0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn),鑒定出2117個(gè)差異表達(dá)基因,包括1347個(gè)上調(diào)基因和770個(gè)下調(diào)基因,有大量差異表達(dá)基因富集到調(diào)控細(xì)胞內(nèi)各種生理生化過(guò)程中,為研究菊花根系的耐鹽調(diào)控機(jī)制提供了豐富的數(shù)據(jù)。3、根據(jù)基因功能注釋、富集結(jié)果以及前人研究,篩選了與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物激素、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、滲透調(diào)節(jié)、抗氧化調(diào)節(jié)、重要功能蛋白相關(guān)的差異表達(dá)基因,以及轉(zhuǎn)錄因子,并從中選取20個(gè)差異倍數(shù)較大的基因作為候選基因,利用qRT-PCR測(cè)定其在鹽脅迫后0、3、6、12、24、36、48 h的表達(dá)模式。不同DEGs的表達(dá)模式有差異,暗示這些基因可能通過(guò)不同的調(diào)控途徑參與菊花根系脅迫響應(yīng),也驗(yàn)證了測(cè)序結(jié)果的可靠性。4、離子含量測(cè)定表明:Ca~(2+)含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì);脅迫初期Na~+外流含量降低,K~+內(nèi)流顯著增大,含量升高,而隨著脅迫時(shí)間的增長(zhǎng)兩者又受到抑制。5、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量測(cè)定表明:鹽脅迫下菊花根系各滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累進(jìn)程不同,脯氨酸含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì),可溶性糖含量始終處于增加狀態(tài),積累較多。6、抗氧化物酶活性測(cè)定表明:POD活性呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì);SOD活性始終受到抑制;CAT活性在初期受到抑制,而后又被激活。綜上所述,本研究基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選菊花根系響應(yīng)鹽脅迫的耐鹽基因,并鑒定候選基因,比較其表達(dá)模式差異,將基因表達(dá)與生理數(shù)據(jù)結(jié)合起來(lái),闡述菊花耐鹽機(jī)理。
【學(xué)位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：S682.11
【部分圖文】：

菊花耐鹽性檢測(cè)（A）REC測(cè)定；（B）MDA含量測(cè)定；（C）葉綠素含量測(cè)定；（D）根系活力測(cè)定Fig.3-1Salttolerancetestofchrysanthemum(A)DeterminationofREC;(B)DeterminationofMDA;(C)Determinationofchlorophyllcontent;(D)Determinationof

基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)栈望}性的研究163.2.2組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析本研究共組裝得到95,476條transcripts和70,764條unigenes，其中unigenes的長(zhǎng)度從200bp到1000+bp不等。大多數(shù)unigenes在200和500bp（59.32%）之間，長(zhǎng)度超過(guò)1000bp的unigenes占10.80%。Transcript的N50為845，unigene的N50為853，組裝完整性較高，具體組裝結(jié)果如表3-1、圖3-2所示。表3-2從頭測(cè)序組裝統(tǒng)計(jì)Table3-2denovotranscriptomeassemblystatisticsAll(>=200bp)>=500bp>=1000bpN50GC(%)TotalLengthMaxLengthMinLengthAverageLengthTranscript95476499471751784543.256886571016890300721Unigene70764356331288585343.385093924516890300719注：N50:將transcript從長(zhǎng)到短排序，依次累加transcript堿基數(shù)，當(dāng)累計(jì)堿基數(shù)達(dá)到transcript總堿基數(shù)50%時(shí)的transcript的長(zhǎng)度，unigene采用相同的方法。Note:N50:Rankthetranscriptfromlongtoshort,andthenaccumulatethenumberoftranscriptbases.Whenthecumulativenumberofbasesreaches50%ofthetotalnumberofbasesinthetranscript,unigeneadoptsthesamemethod.圖3-2unigenes長(zhǎng)度分布和unigenes、transcript長(zhǎng)度分布比對(duì)Fig.3-2Unigeneslengthdistributionandunigenes、transcriptlengthdistribution

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文173.2.3Unigene功能注釋結(jié)果分析本研究將70,764個(gè)unigenes分別與公共數(shù)據(jù)庫(kù)TrEMBL、NR、Pfam、KOG、GO和KEGG比對(duì)，注釋統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3-3，比對(duì)到各數(shù)據(jù)庫(kù)的unigene數(shù)量分別占基因總數(shù)的58.30%、50.50%、43.00%、44.50%、42.80%、11.50%。表3-3Unigene功能注釋成功率統(tǒng)計(jì)Table3-3UnigenefunctionannotationsuccessratestatisticsValuesTotalTrEMBLNRPfamKOGGOKONumber7076441249357263041231510302578164100%58.30%50.50%11.50%Percentage43.00%44.50%42.80%3.2.3.1NR注釋結(jié)果分析NR庫(kù)屬于非冗余蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)，比對(duì)到NR庫(kù)中unigene數(shù)目比例大于1%的物種的分布如圖3-3所示，占總量的比值最大的是擬南芥（Arabidopsisthaliana）為49.6%，其次是水稻（Oryzasativa）占20.9%，集胞藻（Synechocystissp）占1.6%，此外，其他以及未知物種比例為8.6%、2.9%。圖3-3NR庫(kù)注釋物種分布圖Fig.3-3AnnotatedspeciesdistributionmapofNR3.2.3.2KOG注釋結(jié)果分析本研究中有31,510個(gè)unigenes被注釋到KOG數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行功能分類，這些unigenes覆蓋25個(gè)功能類別，其中“基因功能未知”（generalfunctionpredictiononly）基因數(shù)量最多，其次是“翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生”（translation，ribosomalstructureandbiogenesis），“翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、伴侶蛋白”（posttranslationalmodification，proteinturnover，chaperones）和“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制”（signaltransductionmechanisms），具體情況如圖3-4所示。結(jié)果表明，測(cè)序組裝獲得的unigene幾乎覆蓋了基因的全部功
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本文編號(hào)：2880715