在我國,玉米種植一直是農(nóng)業(yè)發(fā)展的基石,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)很大的比例,玉米作為糧食界的三巨頭之一,一直是農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的主導(dǎo),所以其病害對(duì)國民經(jīng)濟(jì)的影響較大。常見的病害葉部病害包括玉米圓斑病、小斑病和大斑病,本文主要針對(duì)玉米大斑病,探索其致病菌——玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)的致病原理及信號(hào)通路。玉米大斑病菌是引發(fā)玉米大斑病的病原真菌,屬典型的絲狀真菌,其致病性受cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控。PKA是cAMP該信號(hào)通路的第二信使的主要效應(yīng)物,它是一個(gè)四具體,包含2個(gè)調(diào)節(jié)亞基R和2個(gè)催化亞基C。本研究主要目的是明確在玉米大斑病菌的致病過程中,PKA及其下游轉(zhuǎn)錄因子StEFG1調(diào)控病菌發(fā)育及致病性的分子機(jī)制。本研究首先驗(yàn)證了 StpkaC2與轉(zhuǎn)錄因子StEFG1的互作關(guān)系,并鑒定了 StEFG1的下游靶基因StRab1;在△SpkaC1、△SpkaC2菌株中,檢測了StRab1基因的表達(dá)水平,并利用Rab特異性抑制劑,通過分析抑制劑對(duì)病菌表型的影響,明確了 Rab對(duì)病菌極性生長的調(diào)控作用。此外,根據(jù)文獻(xiàn)克隆了 PKA下游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 Flo8的編碼基因StFlo8,明確了StFlo8與2個(gè)PKA催化亞基及StEFG1的關(guān)系,同時(shí),通過創(chuàng)制△Stflo8菌株,分析該基因的功能,并對(duì)其下游互作蛋白進(jìn)行了篩選。所得主要結(jié)果如下:1.通過雙分子熒光技術(shù)(BiFC)驗(yàn)證了 StEFG1與StpkaC2的互作關(guān)系。構(gòu)建 pSPYCE(M)-StpkaC2、pSPYCE(M)-StEFG1、pSPYNE(R)-StpkaC2、pSPYNE(R)-StEFG14個(gè)重組載體,兩兩組合后導(dǎo)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞,使重組質(zhì)粒表達(dá),隨后注射入煙草葉片中,觀察煙草葉片中的熒光。在注射組合為pSPYCE(M)-StpkaC2::pSPYNE(R)-StEFG1的煙草葉片中能夠看到GFP的熒光信號(hào),陰性對(duì)照中則未檢測到熒光信號(hào),表明,StpkaC2與StEFG1之間存在互作關(guān)系。2.通過qPCR檢測△SpkaC1、△SpkaC2菌株中與WT菌株差異表達(dá)且與菌絲生長有關(guān)的基因,獲得protein ID為162018的基因。序列分析發(fā)現(xiàn),該基因編碼產(chǎn)物與小G蛋白R(shí)ab1同源性最高,我們將其命名為StRob1,在△SpkaC2菌株中其表達(dá)量達(dá)到WT菌株的13倍,且高于△SpkaC1菌株,與前期所得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相吻合。3.通過凝膠阻滯(EMSA)驗(yàn)證StEFG1與StRob1啟動(dòng)子的互作關(guān)系。生信分析發(fā)現(xiàn),StRab1啟動(dòng)子區(qū)含有StEFG1的識(shí)別序列。將StEFG1進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá),提取并純化活性蛋白,將活性蛋白與探針(含有StEFG1識(shí)別序列的StRab1啟動(dòng)子片段)溫育使之結(jié)合,使用非變性凝膠分離探針,分析二者的互作關(guān)系。探針的長度為30 bp,將探針與StEFG1蛋白進(jìn)行溫育后,在非變性凝膠的80 bp-200 bp之間出現(xiàn)三條主帶,表明蛋白與探針結(jié)合使探針的遷移速率發(fā)生改變,而作為陰性對(duì)照的BSA并沒有改變探針的遷移速率,表明StEFG1蛋白與探針的結(jié)合是特異性的。4.通過qPCR試驗(yàn)檢測StRab1基因在玉米大斑病菌侵染過程不同時(shí)期的表達(dá)量。以成熟菌絲為對(duì)照,β-tubulin基因?yàn)閮?nèi)參,孢子時(shí)期、芽管時(shí)期、附著胞時(shí)期以及侵入釘時(shí)期,該基因的相對(duì)表達(dá)量分別為:0.24、1.14、1.35、4.51。StRab1在侵入釘時(shí)期的表達(dá)水平最高,說明其可能在菌絲極性生長過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。5.通過抑制劑試驗(yàn)驗(yàn)證Rab與菌絲極性生長及幾丁質(zhì)合成的關(guān)系。用抑制劑處理后,△SpkaC2突變體的菌絲生長減緩,產(chǎn)孢能力得到一定的恢復(fù);使用共聚焦顯微鏡觀察經(jīng)幾丁質(zhì)熒光染料著色的菌絲體,發(fā)現(xiàn)抑制劑處理的菌絲末端熒光信號(hào)減弱,說明幾丁質(zhì)的分布減少,菌絲的末端生長受限。6.通過酵母雙雜交試驗(yàn)驗(yàn)證Stflo8與StpkaC1、Stflo8與StEFG1的互作關(guān)系。構(gòu)建pGADT7-StpkaC1/StEFG1/Stflo8、pGBKT7-StpkaC1/StEFG1/Stflo8載體,pGADT7/pGBKT7-Stflo8 與 pGADT7/pGBKT7-StpkaC1、pGADT7/pGBKT7-StEFG1重組質(zhì)粒進(jìn)行組合,轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細(xì)胞后,在缺陷培養(yǎng)基上培養(yǎng),結(jié)果顯示,在SD/-Ade-His-Leu-Trp平板上只有pGADT7-StpkaC1與pGBKT7-Stflo8,pGADT7-Stflo8與 pGBKT7-StEFG1能生長,說明蛋白Stflo8與蛋白StpkaC1和StEFG1之間存在相互作用,而且這種相互作用是特異的。7.創(chuàng)制Stflo8缺失突變體,對(duì)該基因的功能進(jìn)行分析。成功構(gòu)建了Stflo8敲除載體,并將重組載體轉(zhuǎn)化入病原真菌,創(chuàng)制了Stflo8基因敲除突變體。比較基因缺失突變體與野生型的表型,分析該基因的功能。結(jié)果表明,敲除該基因后,病菌的產(chǎn)孢量幾乎為0,野生型在疏水介質(zhì)培養(yǎng)36 h能夠形成侵入釘,而突變體無法形成附著胞,同時(shí)敲除該基因后病菌的黑色素合成能力減弱。8.通過原核誘導(dǎo)表達(dá)Stflo8蛋白,利用Pull-down技術(shù)釣取該基因下游與之互作的蛋白。結(jié)果獲得240多個(gè)蛋白在ncbi中進(jìn)行比對(duì)分析,明確其功能及基因家族,統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)其中6.67%為糖苷水解酶(glycoside hydrolase),4.44%為糖基水解酶(glycosyltransferase),2.22%為碳水化介物酯酶(carbohydrate esterase),其余蛋白質(zhì)尚未標(biāo)記其功能。綜上所述,SpkaC2通過StEFG1調(diào)控StRab1的轉(zhuǎn)錄,影響病菌的極性生長;而SpkaC1通過StFlo8間接作用于StEFG1,調(diào)控StRab1的轉(zhuǎn)錄,對(duì)病菌極性生長的影響小于SpkaC2。研究豐富了對(duì)病菌cAMP信號(hào)途徑作用機(jī)制的認(rèn)識(shí),為尋找病害防控新策略奠定了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：S435.131
【部分圖文】：

ｔｅｍ?ｏｆ?Ａ?ＳｔｐｋａＣ２＼?Ｃ．?Ｃｏｎｉｄｉｕｍ?ｓｔｅｍ?ｏｆ?Ａ?ＳｌｐｋａＣ２￣Ｃ：?Ｄ．??Ｃｏｎｉｄｉｕｍ?ｓｉｅｎｉ?ｏｆ?Ａ?ＳｔｐｋａＣ２?ｗｈｉｃｈ?ｄｉｓｐｏｓｅｄ?ｈｖ?ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．??１〇ｌ??ｒｒｒｒ＾?＼ｖｘ??Ｍ〇?８＂?ＦＴ？！?ｍ?ｓ＾ｔｐｋａＣｌ??、６－議發(fā)?＾３?＾ｔｐｋａＣ：?Ｃ??Ｔ３?：：：：：￥％??Ｓ?４?ＩＩ：：??；?議：：??０３?鐵？??Ｉ?２－?ＩＩ?鬥??０］＾＾￣￣．????圖１１不同菌株孢子產(chǎn)量量化圖??Ｉ＇ｉｉ！?１１?ＱｕａｉＨｉＵｃｄ?ｓｐｏｒｅ?ｙｉｅｌｄ?ｏｒｄｉｆｆｃｒｃｎｌ?ｓｔｒａｉｎｓ??１４．３?Ｕａｂ抑制齊ｉｊ對(duì)病菌／Ｌ丁質(zhì)含量及分布的影響??兒Ｔ質(zhì)的是菌絲極性生長過程中細(xì)胞壁的重要組成成分，力菌絲的屮長發(fā)育??及侵染過程密切相關(guān)，幾丁質(zhì)的含量及分布在病菌侵染的過程中是泠關(guān)爪要的，??ｗ此’購調(diào)介成兒ｒ質(zhì)的能力成為病菌侵染能力的．個(gè)＿ｃ要指標(biāo)。比較分析野－十＾??型１Ｊ突變體相關(guān)能力從而間接鑒定缺失基因?qū)Σ【虏⌒缘恼{(diào)控作Ｈｊ。??八個(gè)幾Ｉ）貞Ａ成Ｗ濃ｗｔ和Ａ?，Ｓ７／如ｒ２中－＿ＵＷ個(gè)Ｍ的表達(dá)松式，提収七凇??人斑病保丨野ｚ�。吞m株ＷＴ、Ａ?５７／＾￡／Ｃ＇２以及Ａ沖？知Ｃ’２－Ｃ等菌株菌絲屮的兒廠??質(zhì)，迎過檢測５３０ｎｍ?Ｋ的提収物溶液的波長來測記提取物中幾丁質(zhì)的含ｍ。??提収液屮兒廠質(zhì)的含祕(mì)越高，則溶液的顏色越深，迎過對(duì)提取液進(jìn)彳Ｔｌ＇ｌ：觀觀??察發(fā)現(xiàn)，及缺尖突變體幾Ｔ質(zhì)提収液的顏＆比野Ａ型更深，而其欠??變體幾Ｍ＇質(zhì)捉収液的顏色則較淺，測定各蘭株兒Ｔ質(zhì)提取液在波長為６

?河北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位（畢業(yè)）論文???３．６?敲除突變體創(chuàng)制??３．６．１聊沾敲除載體構(gòu)建??對(duì)擴(kuò)增的同源臂進(jìn)行凝膠電泳監(jiān)測，得到兩個(gè)大小分別為５２０?ｂｐ、４８０?ｂｐ??的片段，￣其基閃序列相符，對(duì)兩個(gè)［ｎｊ源臂片段進(jìn)行測序，通過ＤＮＡＭＡＮ進(jìn)行??比較分析，朱見突變，利用該目的片段進(jìn)行ｆ續(xù)載體構(gòu)建工作。??識(shí)二：??圖１９敲除載體同源臂１、２菌液ｌ＞ＣＲ檢測凝膠電泳檢樣??Ｆｉｇ．ＩＳ）?Ｋｎｏｃｋｏｕｔ?ｖｅｃｔｏｒ?ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ａｒｍ?１．?２?ｂａｃｔｅｒｉａ?ｌｉｑｕｉｉｌ?ＰＣＲ?ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｓａｍｐｌｅ．??３．６．２?Ａ?Ｓｌｆｈ）Ｈ＾｝＼％＼＼??將新逑的敲除載體通過ＰＥＧ介導(dǎo)的方式轉(zhuǎn)化到玉米大斑病菌中，在具有抗??中素的培奍姑屮進(jìn)行初步篩選，通過抗性篩選，得到部分轉(zhuǎn)化子，進(jìn)—步在抗性??培養(yǎng)站中純化轉(zhuǎn)化了，待轉(zhuǎn)化子能夠穩(wěn)定屮長后，進(jìn)一步進(jìn)行ＤＮＡ水平的檢測，??提取轉(zhuǎn)化丫？及野屯型的基因纟丨１?ＤＮＡ，以構(gòu)讓的敲除載體的質(zhì)粒為模板作為陽性??對(duì)照，以玉米人斑病調(diào)野中型軸Ｗ組ＤＮＡ為模板作為陰性對(duì)照，對(duì)同源臂￣篩??選標(biāo)記的連接部位進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)見Ｖ小，把／Ｈ？佘株轉(zhuǎn)化子中，釕…株能夠擴(kuò)增??，ｌｌｌ，人小為９２６ｂｐ的條帶，ｌＲ＾ａ式驗(yàn)Ｍ，＾到扣Ｍ的試驗(yàn)結(jié)見，獲得？株陽性轉(zhuǎn)??化子，將該轉(zhuǎn)化子進(jìn)－步純化ｆ進(jìn)行炎型觀察以分析基因功能。??圖２０?ｌ）ＮＡ水平驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子電泳檢樣圖??ｌ?ｉｉ！?２０?ＤＮＡ?ｌｅｖｅｌ?＼ｃｎｌｉｃａｌｉｏｎ?ｉｍｃｒｌｃｒ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｄｉａｇｒａｍ??從左到右依次為ＭｍｋＴ

部分轉(zhuǎn)化子，進(jìn)—步在抗性??培養(yǎng)站中純化轉(zhuǎn)化了，待轉(zhuǎn)化子能夠穩(wěn)定屮長后，進(jìn)一步進(jìn)行ＤＮＡ水平的檢測，??提取轉(zhuǎn)化丫？及野屯型的基因纟丨１?ＤＮＡ，以構(gòu)讓的敲除載體的質(zhì)粒為模板作為陽性??對(duì)照，以玉米人斑病調(diào)野中型軸Ｗ組ＤＮＡ為模板作為陰性對(duì)照，對(duì)同源臂￣篩??選標(biāo)記的連接部位進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)見Ｖ小，把／Ｈ？佘株轉(zhuǎn)化子中，釕…株能夠擴(kuò)增??，ｌｌｌ，人小為９２６ｂｐ的條帶，ｌＲ＾ａ式驗(yàn)Ｍ，＾到扣Ｍ的試驗(yàn)結(jié)見，獲得？株陽性轉(zhuǎn)??化子，將該轉(zhuǎn)化子進(jìn)－步純化ｆ進(jìn)行炎型觀察以分析基因功能。??圖２０?ｌ）ＮＡ水平驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子電泳檢樣圖??ｌ?ｉｉ！?２０?ＤＮＡ?ｌｅｖｅｌ?＼ｃｎｌｉｃａｌｉｏｎ?ｉｍｃｒｌｃｒ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｄｉａｇｒａｍ??從左到右依次為ＭｍｋＴ，陽性對(duì)照，陰性對(duì)照，轉(zhuǎn)化子??３４??
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 齊堯堯;張冬梅;周潔;魯國東;;真菌Rab蛋白功能的研究進(jìn)展[J];武夷科學(xué);2011年00期

2 周秀芝;趙巍;王斌;喻娜娜;閆志勇;錢冬萌;宋旭霞;丁守怡;;煙曲霉蛋白激酶A催化亞基對(duì)孢子萌發(fā)和抗氧化損傷的調(diào)節(jié)作用[J];醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào);2010年10期

3 羅璇;石慧;郭城;王金華;;產(chǎn)類胡蘿卜素紅酵母細(xì)胞壁成分分離及含量檢測方法的研究[J];農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊);2010年03期

4 趙縝;樊綺詩;;Rab蛋白在囊泡運(yùn)輸和信號(hào)傳導(dǎo)中的作用[J];生命的化學(xué);2009年05期

5 代養(yǎng)勇,曹健,李浪,曾實(shí),趙陽,張延華;真菌幾丁質(zhì)和殼聚糖研究進(jìn)展[J];鄭州工程學(xué)院學(xué)報(bào);2004年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 葉文雨;稻瘟病菌中小GTP酶激活蛋白（RhoGAPs）的功能分析[D];福建農(nóng)林大學(xué);2013年

2 張冬梅;稻瘟病菌Rab蛋白功能研究[D];福建農(nóng)林大學(xué);2009年

3 沈玉保;酵母cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及時(shí)序衰老機(jī)制研究[D];天津大學(xué);2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 林顥丞;小麥條銹菌幾丁質(zhì)酶基因Pst_23943的功能分析[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2019年

本文編號(hào)：2876577