豬瘟病毒E2蛋白是豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)的囊膜糖蛋白,可誘導(dǎo)動物體產(chǎn)生有效的免疫保護(hù),是研究新型疫苗的主要對象。有研究表明,Gp96N端結(jié)構(gòu)區(qū)的構(gòu)象有α螺旋溝,該區(qū)域與抗原肽結(jié)合能力強,形成的Gp96-抗原肽復(fù)合物非常穩(wěn)定,有潛在的免疫佐劑作用。本研究將Gp96N(26AA-374AA)基因與E2全長基因通過口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus,FMDV)2A基因進(jìn)行融合,然后分別采用真核和原核系統(tǒng)對該重組基因進(jìn)行表達(dá),并對原核表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行免疫原性的測定以探究Gp96N(26AA-374AA)蛋白與佐劑效果。首先,將甲病毒復(fù)制子載體p SFV1進(jìn)行改造,加入真核CMV啟動子和終止區(qū)SV40poly A序列,獲得一新的表達(dá)載體p SCA,然后將EGFP基因、豬瘟病毒E2全長基因及Gp96N端與豬瘟病E2基因的融合片段分別克隆入p SCA載體中,獲得p SCA-EGFP、p SCA-E2和p SCA-GE。轉(zhuǎn)染后實驗結(jié)果表明,p SCA-EGFP質(zhì)粒能夠得到有效表達(dá),p SCA-E2、p SCA-GE能夠得到表達(dá),但是p SCA-E2、p SCA-GE質(zhì)粒表達(dá)效率不高和平均熒光值偏低。其次,將E2基因與串聯(lián)重組蛋白GE基因分別克隆入原核表達(dá)載體p ET-32a(+)中得到重組質(zhì)粒p ET-E2和p ET-GE,轉(zhuǎn)化入Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,分別誘導(dǎo)表達(dá)獲得融合有組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白E2和GE,隨后對重組蛋白表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化摸索最佳表達(dá)條件,并通過梯度尿素法對重組蛋白進(jìn)行粗純化和復(fù)性;采用SDS-PAGE和Western Blotting實驗對目的蛋白進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示表達(dá)的重組蛋白為能與抗體特異性反應(yīng)的目的蛋白。最后,為了研究重組蛋白E2、GE在動物體內(nèi)的免疫原性,將原核表達(dá)的重組蛋白E2、GE和兔化弱毒疫苗以及PBS通過皮下注射免疫小鼠。通過ELISA實驗檢測免疫鼠血清中豬瘟病毒E2蛋白的抗體水平,結(jié)果表明:重組蛋白E2、GE和兔化弱毒疫苗組均產(chǎn)生較高的抗體水平,但是重組蛋白GE免疫組產(chǎn)生的抗體水平反而低于E2重組蛋白免疫組,由此說明Gp96N基因與E2基因串聯(lián)經(jīng)過原核表達(dá)后可能減弱重組蛋白的免疫效果,推測Gp96N基因與E2基因串聯(lián)的位置關(guān)系可能會對原核表達(dá)的重組蛋白的免疫效果產(chǎn)生影響。
【學(xué)位單位】：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S852.651
【部分圖文】：

加熱、缺氧、病毒感染、重金屬中毒、氧化劑等子量大小分為 HSP110、HSP90、HSP70、HSP6，不同分子量的 HSP 在細(xì)胞內(nèi)的分布于表達(dá)也功能、增強生物體的耐熱性、調(diào)控細(xì)胞骨架動力kDa左右的熱激蛋白，是HSP家族中的重要成員界高度保守，細(xì)菌、真菌、哺乳動物、植物等都屬的 GP96 的 C 末端的四個氨基酸均為 Glu-Glu構(gòu)特性由 3 個結(jié)構(gòu)域組成：N 端為 ATP 酶活區(qū)，也 為信號肽序列；中間為帶電的連接區(qū)(M)；N-M可能與機體免疫調(diào)節(jié)相關(guān)，其末端含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 端蛋白的佐劑效果一直是研究的熱點。Gp96N 端包含多肽結(jié)合區(qū)，Vogen 等研究發(fā)現(xiàn) Gp96N 端片顯示 Gp96 的最小多肽結(jié)合位點在其 C 端[43]，源建模，構(gòu)建出來 Gp96N 端（26AA-374AA）

中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所碩士學(xué)位論文 第一章該結(jié)構(gòu)區(qū)的構(gòu)象有 α 螺旋溝，該區(qū)域與抗原肽結(jié)合能力強，形成的 Gp96-抗原肽復(fù)合物非常穩(wěn)定，而且有研究表明 MHC-1 類分子也有與其相同構(gòu)象的肽結(jié)合域[44]。并進(jìn)一步采用DNASTAR 軟件對其進(jìn)一步研究和分析（如下圖 1-2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Gp96N 端蛋白本身也具有許多諸多潛在的抗原位點，蛋白表面構(gòu)型嚴(yán)緊，有良好的親水性，且包含一個可能的跨膜結(jié)構(gòu)域。

SCA、pSCA-E2與pSCA-GE質(zhì)粒按照4ug的驗，具體實驗步驟如下：的 24 孔板，吸去培養(yǎng)液，用 1×PBS 漂洗（丙酮：甲醇=1:1），-20℃固定 30min 或用 500uL 1×PBS 洗細(xì)胞 3 次，將細(xì)胞板中 1×PBS 稀釋的 E2 單抗，37℃孵育 1h;液，用 500uL1×PBS 洗細(xì)胞 3 次，將細(xì)胞板 1×PBS 稀釋的熒光二抗，37℃孵育 1h。稀釋液，用 500uL 1×PBS 洗細(xì)胞 3 次，熒因與 GP96 蛋白基因的擴增及串聯(lián)號：AF333000.1）基因組為模板，經(jīng)過反預(yù)期的 E2 蛋白基因 PCR 產(chǎn)物的大小相符（
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本文編號：2869542