豬瘟病毒E2蛋白是豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)的囊膜糖蛋白,可誘導動物體產生有效的免疫保護,是研究新型疫苗的主要對象。有研究表明,Gp96N端結構區(qū)的構象有α螺旋溝,該區(qū)域與抗原肽結合能力強,形成的Gp96-抗原肽復合物非常穩(wěn)定,有潛在的免疫佐劑作用。本研究將Gp96N(26AA-374AA)基因與E2全長基因通過口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus,FMDV)2A基因進行融合,然后分別采用真核和原核系統(tǒng)對該重組基因進行表達,并對原核表達的重組蛋白進行免疫原性的測定以探究Gp96N(26AA-374AA)蛋白與佐劑效果。首先,將甲病毒復制子載體p SFV1進行改造,加入真核CMV啟動子和終止區(qū)SV40poly A序列,獲得一新的表達載體p SCA,然后將EGFP基因、豬瘟病毒E2全長基因及Gp96N端與豬瘟病E2基因的融合片段分別克隆入p SCA載體中,獲得p SCA-EGFP、p SCA-E2和p SCA-GE。轉染后實驗結果表明,p SCA-EGFP質粒能夠得到有效表達,p SCA-E2、p SCA-GE能夠得到表達,但是p SCA-E2、p SCA-GE質粒表達效率不高和平均熒光值偏低。其次,將E2基因與串聯重組蛋白GE基因分別克隆入原核表達載體p ET-32a(+)中得到重組質粒p ET-E2和p ET-GE,轉化入Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞中,分別誘導表達獲得融合有組氨酸標簽的重組蛋白E2和GE,隨后對重組蛋白表達條件進行優(yōu)化摸索最佳表達條件,并通過梯度尿素法對重組蛋白進行粗純化和復性;采用SDS-PAGE和Western Blotting實驗對目的蛋白進行檢測,結果顯示表達的重組蛋白為能與抗體特異性反應的目的蛋白。最后,為了研究重組蛋白E2、GE在動物體內的免疫原性,將原核表達的重組蛋白E2、GE和兔化弱毒疫苗以及PBS通過皮下注射免疫小鼠。通過ELISA實驗檢測免疫鼠血清中豬瘟病毒E2蛋白的抗體水平,結果表明:重組蛋白E2、GE和兔化弱毒疫苗組均產生較高的抗體水平,但是重組蛋白GE免疫組產生的抗體水平反而低于E2重組蛋白免疫組,由此說明Gp96N基因與E2基因串聯經過原核表達后可能減弱重組蛋白的免疫效果,推測Gp96N基因與E2基因串聯的位置關系可能會對原核表達的重組蛋白的免疫效果產生影響。
【學位單位】：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：S852.651
【部分圖文】：

加熱、缺氧、病毒感染、重金屬中毒、氧化劑等子量大小分為 HSP110、HSP90、HSP70、HSP6，不同分子量的 HSP 在細胞內的分布于表達也功能、增強生物體的耐熱性、調控細胞骨架動力kDa左右的熱激蛋白，是HSP家族中的重要成員界高度保守，細菌、真菌、哺乳動物、植物等都屬的 GP96 的 C 末端的四個氨基酸均為 Glu-Glu構特性由 3 個結構域組成：N 端為 ATP 酶活區(qū)，也 為信號肽序列；中間為帶電的連接區(qū)(M)；N-M可能與機體免疫調節(jié)相關，其末端含有內質網 端蛋白的佐劑效果一直是研究的熱點。Gp96N 端包含多肽結合區(qū)，Vogen 等研究發(fā)現 Gp96N 端片顯示 Gp96 的最小多肽結合位點在其 C 端[43]，源建模，構建出來 Gp96N 端（26AA-374AA）

中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所碩士學位論文 第一章該結構區(qū)的構象有 α 螺旋溝，該區(qū)域與抗原肽結合能力強，形成的 Gp96-抗原肽復合物非常穩(wěn)定，而且有研究表明 MHC-1 類分子也有與其相同構象的肽結合域[44]。并進一步采用DNASTAR 軟件對其進一步研究和分析（如下圖 1-2），結果發(fā)現，Gp96N 端蛋白本身也具有許多諸多潛在的抗原位點，蛋白表面構型嚴緊，有良好的親水性，且包含一個可能的跨膜結構域。

SCA、pSCA-E2與pSCA-GE質粒按照4ug的驗，具體實驗步驟如下：的 24 孔板，吸去培養(yǎng)液，用 1×PBS 漂洗（丙酮：甲醇=1:1），-20℃固定 30min 或用 500uL 1×PBS 洗細胞 3 次，將細胞板中 1×PBS 稀釋的 E2 單抗，37℃孵育 1h;液，用 500uL1×PBS 洗細胞 3 次，將細胞板 1×PBS 稀釋的熒光二抗，37℃孵育 1h。稀釋液，用 500uL 1×PBS 洗細胞 3 次，熒因與 GP96 蛋白基因的擴增及串聯號：AF333000.1）基因組為模板，經過反預期的 E2 蛋白基因 PCR 產物的大小相符（
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本文編號：2869542