太平洋牡蠣是我國(guó)重要的牡蠣養(yǎng)殖種類,近幾年在山東省迅猛發(fā)展,在威海、煙臺(tái)、青島、濱州等地均形成規(guī)�；B(yǎng)殖。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大,貝類病害時(shí)有發(fā)生。牡蠣皰疹病毒1型(Ostreid herpesirus-1,OsHV-1)是已知唯一能夠感染軟體動(dòng)物的皰疹病毒,屬軟體動(dòng)物皰疹病毒科。牡蠣皰疹病毒的主要宿主是雙殼貝類和腹足貝類,感染會(huì)導(dǎo)致貝類的生長(zhǎng)速度減緩,甚至死亡,給貝類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成巨大損失,嚴(yán)重危害我國(guó)海水貝類養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。本論文研究牡蠣皰疹病毒1型感染兩種太平洋牡蠣以及誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答分析。研究結(jié)果顯示,太平洋牡蠣感染OsHV-1后,總死亡率為32%,48 h時(shí)為死亡高峰;透射電鏡觀察結(jié)果表明,閉殼肌內(nèi)發(fā)現(xiàn)了牡蠣皰疹病毒病毒粒子,從內(nèi)至外形分別是病毒核心、殼衣核、囊膜。應(yīng)用TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)了OsHV-1感染二倍體、三倍體太平洋牡蠣后的閉殼肌、消化腺、鰓和外套膜等組織中牡蠣皰疹病毒的載量,結(jié)果表明,各組織均含有OsHV-1,其中二倍體牡蠣的閉殼肌、消化腺、鰓、外套膜在72、84、84、48h病毒含量最高,分別達(dá)到了1.33×10~5、4.45×10~4、5.68×10~4、6.11×10~4 cp/mg;三倍體牡蠣的閉殼肌、消化腺、鰓、外套膜在第2、4、3、2天病毒含量最高,分別達(dá)到了5.25×10~4、6.3×10~3、1.86×10~4、1.55×10~5 cp/mg。在觀察期內(nèi),各組織的病毒含量均是先升高后降低,而后歸于平穩(wěn),但牡蠣在感染120 h后停止死亡,存活的牡蠣體內(nèi)仍存在一定含量的OsHV-1;病理組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn),感染后各器官的結(jié)締組織中都存在組織溶解、細(xì)胞脫落和細(xì)胞核固縮的現(xiàn)象。應(yīng)用qPCR方法研究了OsHV-1感染三倍體太平洋牡蠣的細(xì)胞因子變化情況。研究結(jié)果顯示,在感染期間,實(shí)驗(yàn)組太平洋牡蠣閉殼肌、消化腺、鰓和外套膜中SOD的表達(dá)顯著高于對(duì)照組;消化腺和閉殼肌中REL的表達(dá)顯著高于對(duì)照組;鰓和消化腺中IL-17的表達(dá)顯著高于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組三倍體牡蠣的MyD88在整個(gè)觀察期間都顯著低于對(duì)照組。研究表明,感染OsHV-1后,三倍體太平洋牡蠣的免疫相關(guān)因子表達(dá)發(fā)生了變化,IL-17、REL和SOD的表達(dá)量顯著升高,這是牡蠣抵御OsHV-1的侵襲的免疫反應(yīng);而MyD88的表達(dá)量降低,可能與OsHV-1造成的免疫抑制有關(guān)。總之,OsHV-1可以感染二倍體和三倍體太平洋牡蠣,在其體內(nèi)存活并增殖,造成部分宿主的死亡。感染OsHV-1后,牡蠣的免疫相關(guān)基因差異表達(dá),IL-17、REL和SOD顯著升高,而MyD88呈下降趨勢(shì),這是牡蠣抵御OsHV-1侵襲和OsHV-1感染牡蠣的相互作用。本研究證實(shí),OsHV-1可以感染太平洋牡蠣二倍體和三倍體,探明了二倍體和三倍體太平洋牡蠣感染OsHV-1后的病毒載量及對(duì)三倍體牡蠣免疫相關(guān)基因的差異表達(dá),為進(jìn)一步研究OsHV-1與宿主的相互作用提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：S944.41
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 牡蠣皰疹病毒1 型（OsHV-1）
        1.1.1 牡蠣皰疹病毒1 型（OsHV-1）的流行情況
        1.1.2 牡蠣皰疹病毒1 型（OsHV-1）的臨床癥狀和病理變化
        1.1.3 牡蠣皰疹病毒1 型（OsHV-1）的防治
    1.2 太平洋牡蠣與三倍體
        1.2.1 三倍體牡蠣的優(yōu)勢(shì)
        1.2.2 三倍體牡蠣的誘導(dǎo)方式
    1.3 太平洋牡蠣的免疫系統(tǒng)
        1.3.1 IL-17
        1.3.2 REL
        1.3.3 SOD
        1.3.4 MyD88
    1.4 熒光定量
        1.4.1 SYBR GREENⅠ和探針?lè)?br>        1.4.2 定量方式:絕對(duì)定量和相對(duì)定量
    1.5 本研究的目的和意義
2 材料和方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 患病毛蚶與試驗(yàn)?zāi)迪?br>        2.1.2 主要試劑與配制方法
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 患病毛蚶處理
        2.2.2 DNA模板提取
        2.2.3 PCR檢測(cè)
        2.2.4 熒光定量PCR檢測(cè)
        2.2.5 OsHV-1 對(duì)太平洋牡蠣二倍體、三倍體致病性的研究
        2.2.6 三倍體牡蠣細(xì)胞因子表達(dá)檢測(cè)
3 結(jié)果
    3.1 PCR檢測(cè)和Taq Man熒光定量結(jié)果
        3.1.1 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線
        3.1.2 患病毛蚶檢測(cè)結(jié)果
    3.2 OsHV-1 對(duì)牡蠣的致病性研究
        3.2.1 對(duì)牡蠣麻醉的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.2.2 感染OsHV-1 后牡蠣的癥狀及存活情況
        3.2.3 二倍體三倍體牡蠣感染OsHV-1 后熒光定量檢測(cè)結(jié)果
    3.3 感染OsHV-1 后三倍體牡蠣的病理組織切片觀察和電鏡觀察
        3.3.1 OsHV-1 感染三倍體的病理組織切片觀察
        3.3.2 電鏡觀察
    3.4 免疫相關(guān)基因在不同組織的表達(dá)分析
        3.4.1 閉殼肌
        3.4.2 消化腺
        3.4.3 鰓
        3.4.4 外套膜
4 討論
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
研究生期間的學(xué)術(shù)成果

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本文編號(hào)：2868303