副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,HPS)是一種革蘭氏陰性菌,在豬的上呼吸道中廣泛存在,屬于條件致病菌,是引起豬格拉瑟氏病的病原,患病豬以纖維素性漿膜炎、腦膜炎和多發(fā)性關(guān)節(jié)炎為主要特征,主要影響5-8周齡的保育豬,給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。豬肺泡巨噬細(xì)胞(Porcine alveolar mcrophage cell,PAM)在肺的天然免疫中起到重要作用,是抵御外來病原微生物侵襲肺臟的第一道防線。PAM可以吞噬、殺滅病原,釋放細(xì)胞因子和趨化因子等免疫因子到感染部位發(fā)揮免疫功能,來調(diào)控肺部的炎癥反應(yīng)。本研究通過熱酚水法提取副豬嗜血桿菌的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),分別采用硫酸-苯酚法、紫外分光光度法測(cè)定LPS提取物中多糖及核酸含量,再通過SDSPAGE電泳銀染方法進(jìn)一步鑒定提取物。將提取的LPS作用于豬肺泡巨噬細(xì)胞,探討N LRP3抑制劑對(duì)副豬嗜血桿菌LPS刺激豬肺泡巨噬細(xì)胞中IL-1β表達(dá)量的影響,研究LP S激活TLR4受體進(jìn)而誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路的變化規(guī)律。研究結(jié)果如下:1.副豬嗜血桿菌脂多糖的提取、純化和鑒定采用熱酚水法提取副豬嗜血桿菌血清5型LZ株的LPS,并采用酶解法和超離法純化副豬嗜血桿菌的LPS提取物,從2.46g HPS菌體沉淀中提取純化得到LPS 60mg,平均產(chǎn)率為2.44%。用硫酸-苯酚法測(cè)定結(jié)果顯示,所制備的LPS提取物中不含有還原性單糖,多糖濃度為176μg/mL;微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定結(jié)果顯示,所制備的LPS提取物中核酸含量為430.1μg/mL;銀染鑒定結(jié)果顯示,提取、純化的副豬嗜血桿菌LPS提取物條帶分布在35 kDa~160 kDa之間。2.NLRP3抑制劑對(duì)副豬嗜血桿菌LPS刺激PAM細(xì)胞IL-1β表達(dá)量的影響經(jīng)副豬嗜血桿菌LZ株LPS處理后的細(xì)胞,NLRP3炎性復(fù)合體明顯被激活,而經(jīng)過MCC950抑制劑處理的細(xì)胞NLRP3炎性復(fù)合體的活化明顯被抑制,同時(shí)也抑制了IL-1β的表達(dá)。3.LPS激活TLR4進(jìn)而誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路的變化規(guī)律脂多糖(LPS)刺激后,與對(duì)照組PAM相比較,加入TLR4 siRNA的PAM細(xì)胞質(zhì)中IκB和P65濃度升高,而p-IκB和p-p65濃度降低,細(xì)胞核中p-p65濃度降低。結(jié)果表明,通過TLR4被激活后,副豬嗜血桿菌LPS刺激PAM激活TLR4誘導(dǎo)NF-κB通路,將IκB和部分NF-κB磷酸化,部分游離的NF-κB迅速移位到細(xì)胞核中,細(xì)胞受到刺激后IκB激酶復(fù)合體活化,誘導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)。綜上,副豬嗜血桿菌脂多糖刺激、誘導(dǎo)豬肺泡巨噬細(xì)胞中IL-1β的分泌和NLRP3炎性復(fù)合體的活化,并能激活TLR4蛋白從而引起IκB激酶復(fù)合體活化,導(dǎo)致IκB和NFp65磷酸化。該研究揭示了脂多糖在豬副嗜血桿菌感染中的作用,為副豬嗜血桿菌的防治提供了研究數(shù)據(jù),具有重要意義。
【學(xué)位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：S858.28
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 副豬嗜血桿菌的概述
    1.2 副豬嗜血桿菌的病原型態(tài)及培養(yǎng)特性
    1.3 副豬嗜血桿菌的血清學(xué)研究進(jìn)展
        1.3.1 血清學(xué)分型
        1.3.2 分子生物學(xué)分型
    1.4 副豬嗜血桿菌致病機(jī)制
        1.4.1 副豬嗜血桿菌的毒力因子
        1.4.2 副豬嗜血桿菌逃避肺部的天然免疫
    1.5 副豬嗜血桿菌的臨床癥狀及病理變化
    1.6 副豬嗜血桿菌診斷
    1.7 副豬嗜血桿菌的防控
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 試驗(yàn)相關(guān)設(shè)備儀器
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 副豬嗜血桿菌脂多糖的提取、鑒定和保存
        2.2.2 NLRP3 抑制劑對(duì)副豬嗜血桿菌脂多糖刺激PAM細(xì)胞IL-1β表達(dá)量的影響
        2.2.3 TLR4 對(duì)副豬嗜血桿菌脂多糖刺激PAM細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的影響
3 結(jié)果與分析
    3.1 副豬嗜血桿菌脂多糖的提取、鑒定和保存
        3.1.1 副豬嗜血桿菌脂多糖的純化結(jié)果
        3.1.2 副豬嗜血桿菌脂多糖的定性試驗(yàn)結(jié)果
        3.1.3 副豬嗜血桿菌脂多糖中多糖含量測(cè)定
        3.1.4 副豬嗜血桿菌脂多糖的核酸含量測(cè)定
        3.1.5 副豬嗜血桿菌脂多糖的瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果
        3.1.6 副豬嗜血桿菌脂多糖的銀染鑒定結(jié)果
    3.2 NLRP3 抑制劑對(duì)副豬嗜血桿菌脂多糖刺激PAM細(xì)胞IL-1β表達(dá)量的影響
        3.2.1 IL-1β、NLRP3 表達(dá)量結(jié)果與分析
    3.3 TLR4 對(duì)副豬嗜血桿菌脂多糖刺激PAM細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的影響
        3.3.1 細(xì)胞質(zhì)中IκB、p65 表達(dá)量結(jié)果與分析
        3.3.2 細(xì)胞質(zhì)中p-IκB、p-p65 表達(dá)量結(jié)果與分析
        3.3.3 細(xì)胞核中p-p65 表達(dá)量結(jié)果與分析
4 討論
    4.1 副豬嗜血桿菌脂多糖的提取、鑒定和保存
    4.2 NLRP3 抑制劑對(duì)副豬嗜血桿菌脂多糖刺激PAM細(xì)胞IL-1β表達(dá)量的影響
    4.3 TLR4 對(duì)副豬嗜血桿菌脂多糖刺激PAM細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的影響
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
參與課題情況
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論著

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2859782