由立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)侵染引起的馬鈴薯黑痣病是一種真菌性病害,嚴(yán)重影響馬鈴薯塊莖的產(chǎn)量、外觀品質(zhì)和商品性,以及種薯企業(yè)的種植效益,探索這一病害安全有效的生物防治方法迫在眉睫。本研究通過比較已篩選出的5株生防芽孢桿菌(QHZ-1、QHZ-2、QHZ-3、QHZ-4、QHZ-5)分泌促生物質(zhì)的能力以及脂肽類抗生素合成酶基因的檢測(cè),選擇生防潛力最好的菌株,研究其生防效果及其作用機(jī)理,并優(yōu)化其發(fā)酵條件后制成生物有機(jī)肥,通過盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證其生防效果。主要研究結(jié)果如下:1.供試生防菌可產(chǎn)生大量的促生物質(zhì),菌株QHZ-3的產(chǎn)量顯著高于其它菌株(1)5株生防菌均可分泌鐵載體,其中以菌株QHZ-3的分泌量顯著高于其它菌株。定量分析結(jié)果顯示,QHZ-3在發(fā)酵液中鐵載體的表達(dá)量可達(dá)40.59%,比分泌量最小的QHZ-1增加了14.58%;(2)5株生防菌均有一定的解磷能力,對(duì)Ca_3(PO_4)_2的溶解能力以QHZ-2、QHZ-3和QHZ-4較強(qiáng),發(fā)酵液中有效磷的濃度分別為9.89μg/mL、10.53μg/mL和10.19μg/mL,QHZ-1的解磷能力最差,僅為5.16μg/mL;(3)5株生防菌也可產(chǎn)生大量吲哚乙酸(IAA),其中以菌株QHZ-3和QHZ-5的產(chǎn)量最高,分別為17.20mg/mL和16.18 mg/mL,QHZ-2的產(chǎn)量最低,僅為QHZ-3的51%。2.采用分子生物學(xué)方法檢測(cè)了5株菌的抗生素合成基因,發(fā)現(xiàn)QHZ-1和QHZ-2具有豐原素(Fengycin)和伊枯草菌素(Iturin)合成酶基因;QHZ-4僅具有Fengycin合成酶基因;而QHZ-3與QHZ-5菌株同時(shí)具有表面活性素Surfactin、Iturin和Fengycin三種脂肽類抗生素合成酶基因。綜合比較5株生防菌潛在的促生與拮抗能力,選擇最具生防潛力的QHZ-3進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件、生物有機(jī)肥的研制以及生防效果試驗(yàn)。3.利用LC-MS技術(shù)對(duì)菌株QHZ-3產(chǎn)生的脂肽類抗生素種類進(jìn)行定性,發(fā)現(xiàn)QHZ-3可以分泌Surfactin、Iturin和Fengycin三種脂肽類抗生素。所以,QHZ-3是產(chǎn)脂肽類抗生素菌株。4.菌株QHZ-3的液體及固體發(fā)酵條件優(yōu)化(1)單因素試驗(yàn)結(jié)果表明,QHZ-3液態(tài)發(fā)酵最佳條件為:裝液量60/250mL三角瓶、接種量6%、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、發(fā)酵時(shí)間60h;(2)正交試驗(yàn)結(jié)果顯示:裝液量40/250 mL三角瓶、搖床轉(zhuǎn)速170 r/min、接種量6%、發(fā)酵時(shí)間48h的組合下,QHZ-3的生長(zhǎng)狀態(tài)最佳,活菌數(shù)可達(dá)到1.31×10~(10)cfu·mL~(-1);(3)將QHZ-3接種在腐熟的牛糞有機(jī)肥中,采用優(yōu)化的接種量10%制成QHZ-3產(chǎn)脂肽類生物有機(jī)肥,活菌數(shù)可達(dá)到1.02×10~9 cfu·mL~(-1)。5.盆栽試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)處理:對(duì)照(CK)、QHZ-3菌懸液(QHZ-3)與QHZ-3產(chǎn)脂肽類菌株制成的生物有機(jī)肥(BOF)。在馬鈴薯塊莖形成期測(cè)定了不同處理中植株地上部和根系的生長(zhǎng)情況,以及土壤中病原菌立枯絲核菌的數(shù)量,試驗(yàn)結(jié)果表明:(1)QHZ-3和BOF處理中馬鈴薯植株的株高、莖粗及生物量等均高于CK。BOF處理的效果顯著優(yōu)于QHZ-3,尤其是對(duì)馬鈴薯地下部的生長(zhǎng)影響最為顯著,地下部干重比QHZ-3處理增加了1.81倍;(2)QHZ-3和BOF處理也改善了馬鈴薯植株葉片的形態(tài),增加了葉片厚度,并提高了葉片的葉綠素含量(SPAD值)與光合有效輻射,尤其是BOF處理的SPAD值較CK提高了40.3%,較QHZ-3提高了15.91%;(3)BOF顯著改變了馬鈴薯的根系形態(tài):根表面積、根尖數(shù)與根體積等根系參數(shù)均顯著高于QHZ-3和CK,尤其是BOF的根尖數(shù)分別達(dá)到了CK和QHZ-3處理的4.11與1.82倍,為馬鈴薯根系的吸收創(chuàng)造了條件;(4)BOF處理顯著降低了馬鈴薯根際土壤中黑痣病病原菌立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)的絕對(duì)量。在種植后第60d的定量結(jié)果顯示,BOF處理的馬鈴薯根際土壤中立枯絲核菌的絕對(duì)量降至1.34×10~5 copies/g,比CK(1.02×10~6copies/g)降低了一個(gè)數(shù)量級(jí)。綜上所述,QHZ-3不僅具有顯著的促生作用,而且通過活化土壤養(yǎng)分促進(jìn)了根系的吸收和生長(zhǎng);QHZ-3通過產(chǎn)生多種脂肽類抗生素抑制了病原菌立枯絲核菌的生長(zhǎng),是一株產(chǎn)脂肽類抗生素菌株的高效生防菌株;以此菌株制成的生物有機(jī)肥其作用效果優(yōu)于菌懸液處理,說明生防菌的二次固體發(fā)酵顯著增強(qiáng)了其促生和拮抗能力。
【學(xué)位單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：S435.32;S476.1
【部分圖文】：

產(chǎn)脂肽類菌株QHZ-3對(duì)馬鈴薯黑痣病的生防效果及其機(jī)理研究21的拮抗機(jī)制提供保障，我們對(duì)5株菌中抗菌物質(zhì)合成基因的表達(dá)進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如下。注：M，DNA標(biāo)記DL2000；泳道1-5分別為菌株QHZ-1、QHZ-2、QHZ-3、QHZ-4、QHZ-5，CK模板為ddH2O圖2-45株生防菌fenB功能基因的檢測(cè)分析結(jié)果Fig.2-4DetectionoffunctionalgenesoffenBfrom5strainsofbiocontrolbacteria如圖2-4所示，所有菌株均擴(kuò)增出與目的片段（535bp）相同大小的條帶。結(jié)合測(cè)序結(jié)果，我們可以確定所有菌株均具fengycin合成酶編碼基因。且5株生防菌中的fenB基因與Bacillussubtilisfengycin合成酶基（L42523.1）同源性分為98%、95.28%、95.34%、95.22%、95.22%。針對(duì)抗菌物質(zhì)Iturin，選擇其調(diào)控基因itua基因（616bp）作為合成酶的代表基因進(jìn)行擴(kuò)增。檢測(cè)結(jié)果如圖2-5所示。注：M，DNA標(biāo)記DL2000；泳道1-5分別為菌株QHZ-1、QHZ-2、QHZ-3、QHZ-4、QHZ-5，CK模板為ddH2O圖2-5五株生防菌ituA功能基因的檢測(cè)分析結(jié)果Fig.2-5DetectionoffunctionalgenesofituAfrom5strainsofbiocontrolbacteriaQHZ-1、QHZ-2、QHZ-3、QHZ-5菌株擴(kuò)增得到目的片段大小的明亮條帶，QHZ-1、QHZ-2菌株中的ituA基因序列分別與B.atrophaeusUCMB-5137菌株的ituA基因（CP011802.1）同源性達(dá)到99%和97%，QHZ-3、QHZ-5與B.atrophaeusGQJK17菌株的ituA基因（CP022653.1）同源性達(dá)到99%。結(jié)合測(cè)序結(jié)果我們得知，QHZ-1、QHZ-2、QHZ-3、QHZ-5具iturin合成酶編碼基因。200015001000750500250100M12345CKM12345CK200015001000750500250100200015001000750500250100

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2020屆碩士學(xué)位論文22注：M，DNA標(biāo)記DL2000；泳道1-5分別為菌株QHZ-1、QHZ-2、QHZ-3、QHZ-4、QHZ-5，CK模板為ddH2O圖2-65株生防菌srfAA功能基因的檢測(cè)分析結(jié)果Fig.2-6DetectionoffunctionalgenesofsrfAAfrom5strainsofbiocontrolbacteria從圖2-6可知，5株生防菌中，QHZ-3與QHZ-5擴(kuò)增出與目的基因（221bp）一致的明亮條帶，測(cè)序結(jié)果與BacillussubtilisSurfactin合成酶基（KC454625.1）同源性分別為97%、98%。因此，QHZ-3與QHZ-5具備Surfactin合成酶基因。上述結(jié)果表明，5株生防菌中可檢測(cè)到表面活性素srfAA、伊枯草菌素IturinA、豐原素Fengycin等合成酶基因，因此，5株生防菌株可能通過產(chǎn)生脂肽抗生素抑制病原菌的生長(zhǎng)。3.3優(yōu)良生防菌QHZ-3對(duì)立枯絲核菌的抑菌效果測(cè)定通過上述試驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，在5株生防菌中，QHZ-3產(chǎn)生各種促生物質(zhì)的能力均最強(qiáng)，且該菌株存在抑制植物病原菌的3種脂肽類抗生素合成相關(guān)基因，推測(cè)該菌株可能同時(shí)具有抑制細(xì)菌性與真菌性病原菌活性的作用，是一株理想的生防菌株，為此，以下試驗(yàn)采用QHZ-3菌株為試驗(yàn)對(duì)象。圖2-7菌株QHZ-3對(duì)馬鈴薯黑痣病病原菌的抑制效果M12345CK200015001000750500250100CK

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2020屆碩士學(xué)位論文26圖2-11QHZ-3菌株3種脂肽類物質(zhì)LC-MS檢測(cè)圖Fig.2-11LC-MSforthelipopeptidesantibioticsisolatedfromQHZ-3表2-4QHZ-菌株粗提液中脂肽類抗生素surfactin、iturins以及fengycins分子量測(cè)定Table2-4Calculatedmassvaluesofiturins，fengycinsandsurfactinsinculturelipopeptidesextractsfromQHZ-3脂肽類抗生素分子量MM+H*表面活性素SurfactinSurfactinA（C13）1007.61008.7*SurfactinB（C14）1021.71022.8*SurfactinC（C15）1035.71036.7*伊枯草菌素（Iturins）BacillomycinL（C13）1020.51021.5*豐原素FengycinA（C15/Ala-6）1448.81449.7*FengycinsFengycinC（C17/Ala-6）1476.81477.8*“*”：在QHZ-3脂肽類抗生素質(zhì)譜結(jié)果中檢測(cè)到相應(yīng)的質(zhì)子化峰值ThelipopeptidesincorrespondingpeakoflipopeptidesantibioticfromQHZ-3wasdetectedinspectrum
【參考文獻(xiàn)】

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