本文關(guān)鍵詞：細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素調(diào)控楊樹分生組織活動(dòng)的機(jī)理研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：莖端分生組織(Shoot apical meristem, SAM)的離體發(fā)生是植物基因工程的先決條件,維管形成層的活動(dòng)是植物次生生長(zhǎng)和木材形成的基礎(chǔ)。研究表明細(xì)胞分裂素在離體芽發(fā)生和形成層活動(dòng)過程中均發(fā)揮了至關(guān)重要的作用,然而在木本植物中,其調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚。本研究以84K楊為材料,建立了一套穩(wěn)定的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系。利用人工合成的生長(zhǎng)素響應(yīng)啟動(dòng)子DR5驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因?qū)﹄x體芽發(fā)生過程中生長(zhǎng)素響應(yīng)信號(hào)的分布模式進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,離體芽誘導(dǎo)初期,生長(zhǎng)素響應(yīng)信號(hào)在愈傷組織的邊緣均勻分布,并隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸開始區(qū)域化分布；莖端分生組織開始形成時(shí),DR5::GUS信號(hào)集中在莖端分生組織的上部?jī)蓚?cè)；莖端分生組織形成后,GUS信號(hào)特異分布在L1層細(xì)胞中。原位雜交結(jié)果顯示,編碼楊樹細(xì)胞分裂素B類反應(yīng)調(diào)節(jié)因子的RR12和RRl3基因的表達(dá)信號(hào)在離體芽誘導(dǎo)初期在愈傷組織的邊緣均勻分布,隨后呈現(xiàn)出區(qū)域化集中的分布模式,最終在除L1層細(xì)胞以外的整個(gè)莖端分生組織中均有分布。上述時(shí)空分布模式與擬南芥中的情況是一致的,表明生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素在調(diào)控楊樹和擬南芥離體芽發(fā)生過程中所起的作用是相似的。利用artifical microRNA手段同時(shí)下調(diào)這兩個(gè)基因的表達(dá)獲得了一系列amiR-RR12,13轉(zhuǎn)基因株系。選取轉(zhuǎn)基因植株葉片進(jìn)行離體芽誘導(dǎo),結(jié)果發(fā)現(xiàn)與野生型相比,RR12和RR13的表達(dá)量下調(diào)后,導(dǎo)致離體芽發(fā)生頻率和每塊外植體上形成離體芽的數(shù)目均明顯降低,表明RR12和RR13參與了楊樹離體芽的發(fā)生過程。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn),RR12和RR13在維管形成層區(qū)域有較強(qiáng)的表達(dá)信號(hào)。下調(diào)RRl2和RR13的表達(dá)量造成楊樹植株生長(zhǎng)受到抑制。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,amiR-RR12,13轉(zhuǎn)基因植株莖第20節(jié)的直徑明顯小于野生型對(duì)照。細(xì)胞學(xué)分析發(fā)現(xiàn),與野生型相比,amiR-RR12,13轉(zhuǎn)基因植株莖的次生木質(zhì)部和次生韌皮部比例降低、次生生長(zhǎng)受到了抑制。qRT-PCR結(jié)果顯示RR12和RR13在amiR-RR12,13轉(zhuǎn)基因植株莖中的轉(zhuǎn)錄水平明顯降低,而其他B類RRs未表現(xiàn)出明顯變化,表明上述表型是特異降低RR12和RR13轉(zhuǎn)錄水平的結(jié)果。這些結(jié)果說明RR12和RR13通過維持維管形成層的正�；顒�(dòng)參與了對(duì)次生生長(zhǎng)過程的調(diào)控。本研究的結(jié)果表明,細(xì)胞分裂素通過其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的RR12和RR13介導(dǎo)了離體芽的發(fā)生和維管形成層的活動(dòng),并在上述過程中發(fā)揮了正向調(diào)控作用。
【關(guān)鍵詞】：楊樹 芽發(fā)生 生長(zhǎng)素 細(xì)胞分裂素 細(xì)胞分裂素反應(yīng)調(diào)節(jié)因子 形成層
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S792.11
【目錄】：

• 符號(hào)說明4-8
• 中文摘要8-9
• Abstract9-11
• 1 前言11-25
• 1.1 細(xì)胞分裂素11-16
• 1.1.1 細(xì)胞分裂素的生物合成11-13
• 1.1.2 細(xì)胞分裂素的運(yùn)輸13
• 1.1.3 細(xì)胞分裂素的代謝13
• 1.1.4 細(xì)胞分裂素的信號(hào)傳導(dǎo)13-16
• 1.2 植物離體芽發(fā)生的分子機(jī)理16-19
• 1.2.1 植物離體芽發(fā)生分子機(jī)理的研究進(jìn)展16-18
• 1.2.2 楊樹離體芽發(fā)生相關(guān)研究18-19
• 1.3 植物維管形成層活動(dòng)的機(jī)理19-24
• 1.3.1 植物維管形成層的結(jié)構(gòu)20
• 1.3.2 植物形成層發(fā)生及發(fā)育20-21
• 1.3.3 植物形成層活動(dòng)的分子調(diào)控機(jī)制21-23
• 1.3.4 細(xì)胞分裂素對(duì)形成層生長(zhǎng)的調(diào)控機(jī)理23-24
• 1.4 本研究的目的意義24-25
• 2 材料與方法25-42
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料25-26
• 2.1.1 植物材料和生長(zhǎng)條件25
• 2.1.2 菌株和質(zhì)粒25
• 2.1.3 試劑和儀器25-26
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法26-42
• 2.2.1 植物總RNA的提取26-27
• 2.2.1.1 檢測(cè)RNA的質(zhì)量和濃度26-27
• 2.2.1.2 反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈的合成27
• 2.2.2 植物基因組DNA的提取27
• 2.2.3 Artificial microRNA沉默RR12/13基因表達(dá)載體的構(gòu)建27-30
• 2.2.4 質(zhì)粒的提取30
• 2.2.5 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(熱擊法)30-31
• 2.2.6 大腸桿菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化31-32
• 2.2.7 目的片段和質(zhì)粒DNA的酶切與回收32
• 2.2.8 DNA測(cè)序32
• 2.2.9 GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備32
• 2.2.10 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(電擊法)32-33
• 2.2.11 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的楊樹葉盤法遺傳轉(zhuǎn)化及抗性植株的獲得33-34
• 2.2.12 轉(zhuǎn)基因楊樹的GUS染色鑒定和石蠟切片34-35
• 2.2.12.1 對(duì)轉(zhuǎn)DR5：：GUS的楊樹取材固定進(jìn)行GUS染色34
• 2.2.12.2 材料脫水、透明、浸蠟和包埋34-35
• 2.2.12.3 切片35
• 2.2.12.4 TBO染色35
• 2.2.13 實(shí)時(shí)定量PCR分析35-36
• 2.2.14 原位雜交分析36-42
• 2.2.14.1 材料的固定36
• 2.2.14.2 材料的包埋36-37
• 2.2.14.3 切片37
• 2.2.14.4 探針標(biāo)記37-40
• 2.2.14.5 脫蠟、消化、乙�；碗s交40-41
• 2.2.14.6 洗片41
• 2.2.14.7 檢測(cè)41-42
• 3 結(jié)果與分析42-54
• 3.1 楊樹遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立42-45
• 3.1.1 楊樹離體芽發(fā)生系統(tǒng)的建立42-43
• 3.1.2 楊樹遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立43-45
• 3.2 楊樹離體芽發(fā)生過程中激素響應(yīng)信號(hào)的分布模式45-49
• 3.2.1 生長(zhǎng)素響應(yīng)信號(hào)在楊樹離體芽發(fā)生過程中的分布模式45-47
• 3.2.2 細(xì)胞分裂素反應(yīng)調(diào)節(jié)因子編碼基因在楊樹離體芽發(fā)生過程中的表達(dá)模式47-49
• 3.3 細(xì)胞分裂素反應(yīng)調(diào)節(jié)因子RR12和RR13調(diào)控楊樹離體芽發(fā)生49-51
• 3.3.1 AmiR-RR12,13轉(zhuǎn)基因株系的獲得49-50
• 3.3.2 敲除RR12和RR13抑制了離體芽的發(fā)生50-51
• 3.4 細(xì)胞分裂素反應(yīng)調(diào)節(jié)因子RR12和RR13調(diào)控楊樹莖的次生生長(zhǎng)51-54
• 3.4.1 RR12和RR13在楊樹莖中的表達(dá)模式分析51-52
• 3.4.2 RR12和RR13調(diào)控楊樹莖的次生生長(zhǎng)52-54
• 4 討論54-57
• 5 結(jié)論57-58
• 參考文獻(xiàn)58-66
• 致謝66

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