本文關(guān)鍵詞：福氏志賀菌基因組分析及耐藥機(jī)理研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：志賀氏菌病又稱(chēng)細(xì)菌性痢疾,是一種具有高度傳染性和嚴(yán)重危害性的腸道傳染病,嚴(yán)重危害人類(lèi)的健康和生命安全,在我國(guó)流行的優(yōu)勢(shì)菌株為福氏志賀菌2a型,其主要感染人群為5歲以下的兒童和免疫障礙的人群。世界衛(wèi)生組織推薦治療菌痢的首選藥物為環(huán)丙沙星,其次為頭抱曲松和匹美西林。本文采用臨床常用的環(huán)丙沙星、頭孢曲松和一種廣譜抗生素四環(huán)素分別誘導(dǎo)福氏志賀菌301株產(chǎn)生耐藥性,然后對(duì)菌株基因組測(cè)序,從而在基因組水平研究其耐藥機(jī)理。1.根據(jù)Gene Bank中發(fā)表的各志賀菌血清型特性基因ipa H(M32063)、gtrⅡ(AF021347)、gtrⅩ(L05001)、R002(AF250878)組成多重PCR體系,用于福氏志賀菌301株的驗(yàn)證,能夠在多種細(xì)菌中快速、靈敏、特異的檢測(cè)出福氏志賀菌301株,不僅為之后實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保證菌株不受污染奠定了基礎(chǔ),同時(shí)創(chuàng)造出了一種快速檢測(cè)分離志賀菌的有效方法。2.利用一系列梯度濃度的環(huán)丙沙星、頭孢曲松、四環(huán)素對(duì)福氏志賀菌標(biāo)準(zhǔn)株分別誘導(dǎo)后其MIC分別為64μg/m L、64μg/m L、128μg/m L,均已達(dá)到耐藥水平。依據(jù)各抗生素誘導(dǎo)菌株MIC增長(zhǎng)曲線我們選定福氏志賀菌301株標(biāo)準(zhǔn)菌進(jìn)行de novo測(cè)序,環(huán)丙沙星、四環(huán)素誘導(dǎo)的5、7、10代和頭孢曲松誘導(dǎo)的5、9、10代進(jìn)行重測(cè)序。3.de novo測(cè)序共產(chǎn)生732 Mb數(shù)據(jù),組裝后經(jīng)基因組組分分析得到4,832個(gè)基因,78個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列,44個(gè)小衛(wèi)星序列,11個(gè)微衛(wèi)星序列,102個(gè)t RNA和16個(gè)r RNA。然后采用GO、KEGG、Swiss-Prot、COG、NR、Tremble、CAZy、ARDB、VFDB、PHI、T3SS等多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)得到的4832個(gè)基因序列進(jìn)行基因名、基因功能注釋和分類(lèi),針對(duì)各數(shù)據(jù)庫(kù)特征,綜合利用各數(shù)據(jù)庫(kù)的優(yōu)點(diǎn)完善實(shí)驗(yàn)研究。利用de novo測(cè)序數(shù)據(jù)與已公布的福氏志賀菌301株基因組(NC_004337)比對(duì)檢測(cè)到317個(gè)SNP位點(diǎn),包括74個(gè)同義突變;237個(gè)非同義突變和6個(gè)無(wú)義突變。4.重測(cè)序序列與de novo序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)多個(gè)突變位點(diǎn),即met G基因位點(diǎn)284497在TC-2、CIP-2、CRO-3中由T-G的突變;gyr B基因位點(diǎn)1953446在CIP-2中由C-A的突變;gyd A基因位點(diǎn)670796在CIP-7中由A-C的突變;rob基因位點(diǎn)335049在CIP-10中由G-A的突變;nar X基因位點(diǎn)1072783在CRO-8中由A-G的突變。以及間區(qū)位點(diǎn)1538933在CIP3、CRO3、TC3中由A-T;1538929在CIP5、CR04、TC5中由G-A;1538924在CIP8、CRO8、TC5中由G-C。5.對(duì)共有的突變基因met G(甲硫氨酰t RNA合成酶)功能注釋發(fā)現(xiàn),met G主要影響甲硫氨酸的活化與轉(zhuǎn)移,且影響其他氨基酸的活化,在KEGG途徑注釋發(fā)現(xiàn)met G最終影響蛋白質(zhì)的合成。間區(qū)突變會(huì)影響酞酰脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶ppi A的功能。研究表明met G和ppi A基因突變不僅影響蛋白質(zhì)的合成,而且還是一個(gè)潛在的抗生素靶標(biāo)。
【關(guān)鍵詞】：福氏志賀菌 耐藥性 de novo 重測(cè)序 基因突變
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S852.61
【目錄】：

• 附件3-5
• 摘要5-6
• Abstract6-12
• 英文縮略表12-13
• 第一章 引言13-21
• 1.1 志賀菌病的危害及其分類(lèi)13-14
• 1.2 細(xì)菌耐藥機(jī)理研究進(jìn)展14-16
• 1.2.1 產(chǎn)生滅活酶或鈍化酶14
• 1.2.2 抗生素滲透障礙14-15
• 1.2.3 影響細(xì)菌外排作用15
• 1.2.4 抗生素作用靶位的改變15
• 1.2.5 總結(jié)15-16
• 1.3 高通量測(cè)序技術(shù)16-17
• 1.3.1 Illumina測(cè)序原理16
• 1.3.2 Illumina測(cè)序應(yīng)用16
• 1.3.3 高通量測(cè)序在細(xì)菌耐藥性研究中的應(yīng)用16-17
• 1.3.4 高通量測(cè)序在細(xì)菌耐藥性研究中的應(yīng)用17
• 1.4 細(xì)菌非編碼小RNA研究17-19
• 1.4.1 細(xì)菌sRNA分類(lèi)17-18
• 1.4.2 細(xì)菌sRNA的相關(guān)功能18
• 1.4.3 sRNA分子伴侶Hfq蛋白18-19
• 1.4.4 sRNA研究方法19
• 1.5 本研究意義19-21
• 第二章 福氏志賀菌2型多重PCR分型及應(yīng)用21-27
• 2.1 材料與方法21-23
• 2.1.1 菌株21
• 2.1.2 模板制備21
• 2.1.3 目的基因的克隆及條件優(yōu)化21-23
• 2.2 結(jié)果與分析23-26
• 2.2.1 單重PCR對(duì)引物特異性驗(yàn)證結(jié)果23
• 2.2.2 多重PCR條件的優(yōu)化23-24
• 2.2.3 模板用量?jī)?yōu)化24-25
• 2.2.4 靈敏度檢測(cè)25-26
• 2.3 討論26-27
• 第三章 福氏志賀菌 2a 301株耐藥菌株的構(gòu)建27-31
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料27-28
• 3.1.1 菌株27
• 3.1.2 主要設(shè)備與試劑27-28
• 3.2 試驗(yàn)方法28-29
• 3.2.1 抗生素貯存原液的配制28
• 3.2.2 福氏志賀菌301株標(biāo)準(zhǔn)株MIC測(cè)定28
• 3.2.3 藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)28
• 3.2.4 福氏志賀菌301株耐藥菌株誘導(dǎo)28-29
• 3.3 結(jié)果與分析29-30
• 3.4 討論30-31
• 第四章 福氏志賀菌301株基因組測(cè)序及耐藥基因篩選31-48
• 4.1 樣品及試劑、儀器31
• 4.2 試驗(yàn)方法31-33
• 4.2.1 DNA提取31
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)流程31-32
• 4.2.3 生物信息分析流程32-33
• 4.2.4 測(cè)序結(jié)果組裝組裝33
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析33-46
• 4.3.1 de novo測(cè)序結(jié)果33-34
• 4.3.2 原始數(shù)據(jù)質(zhì)控34
• 4.3.3 結(jié)果評(píng)價(jià)34-36
• 4.3.4 基因組份分析36-38
• 4.3.5 基因功能分析38-41
• 4.3.6 比較基因組分析41-44
• 4.3.7 de novo測(cè)序結(jié)果與參考序列對(duì)比結(jié)果44-46
• 4.4 討論46-48
• 4.4.1 細(xì)菌基因組de nove46
• 4.4.2 基因數(shù)據(jù)庫(kù)應(yīng)用46-47
• 4.4.3 SNP突變與插入缺失47-48
• 第五章 福氏志賀菌耐藥誘導(dǎo)菌株重測(cè)序及突變位點(diǎn)驗(yàn)證48-57
• 5.1 樣品及試劑、儀器48
• 5.2 試驗(yàn)方法48-52
• 5.2.1 DNA提取與試驗(yàn)流程48
• 5.2.2 細(xì)菌重測(cè)序生物信息分析流程48-49
• 5.2.3 原始數(shù)據(jù)質(zhì)控49
• 5.2.4 組裝49
• 5.2.5 比較基因組分析49-50
• 5.2.6 突變位點(diǎn)驗(yàn)證50-52
• 5.3 結(jié)果與分析52-55
• 5.3.1 測(cè)序數(shù)據(jù)概況52
• 5.3.2 比較基因組分析52-54
• 5.3.3 測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證54
• 5.3.4 多耐藥基因代謝通路分析54-55
• 5.4 討論55-57
• 第六章 全文結(jié)論57-58
• 參考文獻(xiàn)58-65
• 致謝65-66
• 作者簡(jiǎn)介66

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：284578