本文關鍵詞：福氏志賀菌基因組分析及耐藥機理研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：志賀氏菌病又稱細菌性痢疾,是一種具有高度傳染性和嚴重危害性的腸道傳染病,嚴重危害人類的健康和生命安全,在我國流行的優(yōu)勢菌株為福氏志賀菌2a型,其主要感染人群為5歲以下的兒童和免疫障礙的人群。世界衛(wèi)生組織推薦治療菌痢的首選藥物為環(huán)丙沙星,其次為頭抱曲松和匹美西林。本文采用臨床常用的環(huán)丙沙星、頭孢曲松和一種廣譜抗生素四環(huán)素分別誘導福氏志賀菌301株產生耐藥性,然后對菌株基因組測序,從而在基因組水平研究其耐藥機理。1.根據(jù)Gene Bank中發(fā)表的各志賀菌血清型特性基因ipa H(M32063)、gtrⅡ(AF021347)、gtrⅩ(L05001)、R002(AF250878)組成多重PCR體系,用于福氏志賀菌301株的驗證,能夠在多種細菌中快速、靈敏、特異的檢測出福氏志賀菌301株,不僅為之后實驗過程中保證菌株不受污染奠定了基礎,同時創(chuàng)造出了一種快速檢測分離志賀菌的有效方法。2.利用一系列梯度濃度的環(huán)丙沙星、頭孢曲松、四環(huán)素對福氏志賀菌標準株分別誘導后其MIC分別為64μg/m L、64μg/m L、128μg/m L,均已達到耐藥水平。依據(jù)各抗生素誘導菌株MIC增長曲線我們選定福氏志賀菌301株標準菌進行de novo測序,環(huán)丙沙星、四環(huán)素誘導的5、7、10代和頭孢曲松誘導的5、9、10代進行重測序。3.de novo測序共產生732 Mb數(shù)據(jù),組裝后經(jīng)基因組組分分析得到4,832個基因,78個串聯(lián)重復序列,44個小衛(wèi)星序列,11個微衛(wèi)星序列,102個t RNA和16個r RNA。然后采用GO、KEGG、Swiss-Prot、COG、NR、Tremble、CAZy、ARDB、VFDB、PHI、T3SS等多個數(shù)據(jù)庫對得到的4832個基因序列進行基因名、基因功能注釋和分類,針對各數(shù)據(jù)庫特征,綜合利用各數(shù)據(jù)庫的優(yōu)點完善實驗研究。利用de novo測序數(shù)據(jù)與已公布的福氏志賀菌301株基因組(NC_004337)比對檢測到317個SNP位點,包括74個同義突變;237個非同義突變和6個無義突變。4.重測序序列與de novo序列比對后發(fā)現(xiàn)多個突變位點,即met G基因位點284497在TC-2、CIP-2、CRO-3中由T-G的突變;gyr B基因位點1953446在CIP-2中由C-A的突變;gyd A基因位點670796在CIP-7中由A-C的突變;rob基因位點335049在CIP-10中由G-A的突變;nar X基因位點1072783在CRO-8中由A-G的突變。以及間區(qū)位點1538933在CIP3、CRO3、TC3中由A-T;1538929在CIP5、CR04、TC5中由G-A;1538924在CIP8、CRO8、TC5中由G-C。5.對共有的突變基因met G(甲硫氨酰t RNA合成酶)功能注釋發(fā)現(xiàn),met G主要影響甲硫氨酸的活化與轉移,且影響其他氨基酸的活化,在KEGG途徑注釋發(fā)現(xiàn)met G最終影響蛋白質的合成。間區(qū)突變會影響酞酰脯氨酰順反異構酶ppi A的功能。研究表明met G和ppi A基因突變不僅影響蛋白質的合成,而且還是一個潛在的抗生素靶標。
【關鍵詞】：福氏志賀菌 耐藥性 de novo 重測序 基因突變
【學位授予單位】：中國農業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 附件3-5
• 摘要5-6
• Abstract6-12
• 英文縮略表12-13
• 第一章 引言13-21
• 1.1 志賀菌病的危害及其分類13-14
• 1.2 細菌耐藥機理研究進展14-16
• 1.2.1 產生滅活酶或鈍化酶14
• 1.2.2 抗生素滲透障礙14-15
• 1.2.3 影響細菌外排作用15
• 1.2.4 抗生素作用靶位的改變15
• 1.2.5 總結15-16
• 1.3 高通量測序技術16-17
• 1.3.1 Illumina測序原理16
• 1.3.2 Illumina測序應用16
• 1.3.3 高通量測序在細菌耐藥性研究中的應用16-17
• 1.3.4 高通量測序在細菌耐藥性研究中的應用17
• 1.4 細菌非編碼小RNA研究17-19
• 1.4.1 細菌sRNA分類17-18
• 1.4.2 細菌sRNA的相關功能18
• 1.4.3 sRNA分子伴侶Hfq蛋白18-19
• 1.4.4 sRNA研究方法19
• 1.5 本研究意義19-21
• 第二章 福氏志賀菌2型多重PCR分型及應用21-27
• 2.1 材料與方法21-23
• 2.1.1 菌株21
• 2.1.2 模板制備21
• 2.1.3 目的基因的克隆及條件優(yōu)化21-23
• 2.2 結果與分析23-26
• 2.2.1 單重PCR對引物特異性驗證結果23
• 2.2.2 多重PCR條件的優(yōu)化23-24
• 2.2.3 模板用量優(yōu)化24-25
• 2.2.4 靈敏度檢測25-26
• 2.3 討論26-27
• 第三章 福氏志賀菌 2a 301株耐藥菌株的構建27-31
• 3.1 實驗材料27-28
• 3.1.1 菌株27
• 3.1.2 主要設備與試劑27-28
• 3.2 試驗方法28-29
• 3.2.1 抗生素貯存原液的配制28
• 3.2.2 福氏志賀菌301株標準株MIC測定28
• 3.2.3 藥敏試驗判定標準28
• 3.2.4 福氏志賀菌301株耐藥菌株誘導28-29
• 3.3 結果與分析29-30
• 3.4 討論30-31
• 第四章 福氏志賀菌301株基因組測序及耐藥基因篩選31-48
• 4.1 樣品及試劑、儀器31
• 4.2 試驗方法31-33
• 4.2.1 DNA提取31
• 4.2.2 實驗流程31-32
• 4.2.3 生物信息分析流程32-33
• 4.2.4 測序結果組裝組裝33
• 4.3 實驗結果與分析33-46
• 4.3.1 de novo測序結果33-34
• 4.3.2 原始數(shù)據(jù)質控34
• 4.3.3 結果評價34-36
• 4.3.4 基因組份分析36-38
• 4.3.5 基因功能分析38-41
• 4.3.6 比較基因組分析41-44
• 4.3.7 de novo測序結果與參考序列對比結果44-46
• 4.4 討論46-48
• 4.4.1 細菌基因組de nove46
• 4.4.2 基因數(shù)據(jù)庫應用46-47
• 4.4.3 SNP突變與插入缺失47-48
• 第五章 福氏志賀菌耐藥誘導菌株重測序及突變位點驗證48-57
• 5.1 樣品及試劑、儀器48
• 5.2 試驗方法48-52
• 5.2.1 DNA提取與試驗流程48
• 5.2.2 細菌重測序生物信息分析流程48-49
• 5.2.3 原始數(shù)據(jù)質控49
• 5.2.4 組裝49
• 5.2.5 比較基因組分析49-50
• 5.2.6 突變位點驗證50-52
• 5.3 結果與分析52-55
• 5.3.1 測序數(shù)據(jù)概況52
• 5.3.2 比較基因組分析52-54
• 5.3.3 測序結果驗證54
• 5.3.4 多耐藥基因代謝通路分析54-55
• 5.4 討論55-57
• 第六章 全文結論57-58
• 參考文獻58-65
• 致謝65-66
• 作者簡介66

【參考文獻】

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本文編號：284578