【摘要】：大豆油脂是世界植物油脂的主要來源,因其對人類和植物具有重要的生理功能而倍受關(guān)注。由于大豆脂肪酸受遺傳和環(huán)境因子綜合影響,因此開展多環(huán)境條件下大豆脂肪酸主要組分QTL定位和候選基因克隆研究,對大豆脂肪酸分子標(biāo)記輔助育種具有重要意義。本文在建立了大豆脂肪酸組分的定性定量測定方法基礎(chǔ)上,選用以魯黑豆2號(hào)(LHD2)×南匯早黑豆(NHZ)為親本構(gòu)建的重組自交系群體(RIL,F5:7-8)為材料,結(jié)合多環(huán)境下的脂肪酸含量數(shù)據(jù)以及所構(gòu)建的基于SSR和SNP標(biāo)記的大豆高密度遺傳連鎖圖譜信息,采用生物信息學(xué)分析方法,進(jìn)行多環(huán)境條件下脂肪酸主要組分的QTL定位和生物學(xué)信息分析;挖掘與脂肪酸相關(guān)的候選基因,經(jīng)與參考基因組比對,并將其編碼基因在雙親中進(jìn)行同源克隆和測序分析,發(fā)現(xiàn)雙親間存在差異的基因;通過設(shè)計(jì)特異性引物,在RIL群體中驗(yàn)證連鎖關(guān)系;采用實(shí)時(shí)定量PCR方法,檢測候選基因在種子發(fā)育過程中的時(shí)空表達(dá)變化,探索這兩個(gè)基因與脂肪酸合成途徑的相關(guān)性。其主要研究結(jié)論如下:1.定性定量檢測大豆脂肪酸組分的氣相色譜方法采用加熱甲酯化提取法和氣相色譜分析法(GC),以5種脂肪酸甲酯(亞麻酸甲酯、油酸甲酯、棕櫚酸甲酯、亞油酸甲酯和硬脂酸甲酯)為標(biāo)準(zhǔn)樣品,在制定5種脂肪酸甲酯組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線(R20.99)和回歸方程的基礎(chǔ)上,建立了大豆脂肪酸組分的定性定量測定方法。該方法可以定性定量準(zhǔn)確檢測大豆籽粒中脂肪酸組分的絕對含量。通過對4個(gè)油份含量不同的大豆品種脂肪酸含量測定以及與粗脂肪含量的比較分析發(fā)現(xiàn),該方法可顯著提高籽粒中的脂肪酸提取率和檢測效率,其檢測的總脂肪酸含量占總油脂含量的94%以上。該方法不僅能檢測樣品中5種脂肪酸組分的相對百分比含量,還可以準(zhǔn)確計(jì)算出籽粒中各個(gè)脂肪酸組分的絕對含量,對大豆脂肪酸檢測及育種具有重要意義。2.基于SSR和SNP標(biāo)記的大豆脂肪酸組分的QTL定位以包含110個(gè)家系的RIL群體為材料,構(gòu)建一張包含161個(gè)SSR標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜,圖譜全長3 591.18 c M,標(biāo)記間平均圖距為22.31 c M。結(jié)合3年大豆籽粒的脂肪酸組分相對含量表型數(shù)據(jù),利用ICIMpping v3.3軟件,采用ICIM方法進(jìn)行QTL定位,共檢測到與脂肪酸相關(guān)的QTL 52個(gè),分布于除4號(hào)染色體以外的其他19個(gè)連鎖群上,表型貢獻(xiàn)率為5%~40%。其中,15個(gè)QTL為新定位到的位點(diǎn)。另外,在多環(huán)境和多組分間定位到的QTL有17個(gè),表型貢獻(xiàn)率為5%~24%。為了實(shí)現(xiàn)大豆脂肪酸組分的精細(xì)定位,采用SLAF-seq的方法構(gòu)建了一張包含5785個(gè)SNP標(biāo)記的高密度遺傳連鎖圖譜,總長度為2255.18 c M,標(biāo)記間的平均距離為0.39 c M。采用ICIM方法定位到與脂肪酸組分相關(guān)的QTL 24個(gè),分布于12條連鎖群。這些QTL可解釋表型變異7%~31%,LOD值在3.66~10.4之間。其中,3個(gè)QTL(q S-FA12-1、q S-OA16-1和q S-LNA20-1)在多個(gè)環(huán)境下均被檢測到與同一脂肪酸組分相關(guān),2個(gè)QTL(q S-FA7-1和q S-FA12-2)被檢測到同一環(huán)境下調(diào)控不同脂肪酸性狀。在基于SSR標(biāo)記定位到的控制亞麻酸合成的QTL q LNA6-1在多環(huán)境下表現(xiàn)穩(wěn)定,PVE高達(dá)28.76%,可視為主效QTL。經(jīng)過SNP標(biāo)記的精細(xì)定位,在該區(qū)間內(nèi)精細(xì)定位到4個(gè)QTL:與亞油酸相關(guān)的q S-LA6-1、與亞麻酸相關(guān)的q S-LNA6-1、與油酸相關(guān)的q S-OA6-1和與棕櫚酸相關(guān)的q S-PA6-1,其表型貢獻(xiàn)率在11.4%~23.1%之間,為下一步的候選基因克隆奠定了基礎(chǔ)。3.大豆脂肪酸相關(guān)候選基因的克隆與差異比較通過與參考基因組比對,對關(guān)鍵區(qū)間內(nèi)10個(gè)候選基因進(jìn)行了克隆和測序,發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因在雙親間存在差異,經(jīng)GO注釋,發(fā)現(xiàn)分別為DOF類轉(zhuǎn)錄因子基因Gm08DOF-1和MYB類轉(zhuǎn)錄因子基因Gm20MYB-1。Gm08DOF-1在雙親中有連續(xù)3個(gè)堿基的In Del缺失變異,引起NHZ中一組脯氨酸的缺失;Gm20MYB-1在雙親中發(fā)現(xiàn)一個(gè)SNP(C/T)差異,相應(yīng)引起苯丙氨酸和亮氨酸編碼的變化。利用2對特異性引物對2個(gè)差異位點(diǎn)在RIL群體中的表現(xiàn)進(jìn)行檢測,結(jié)合三個(gè)環(huán)境下的脂肪酸含量數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果顯示,除硬脂酸組分外,其余四種脂肪酸組分均在不同環(huán)境下與2個(gè)差異位點(diǎn)呈現(xiàn)顯著相關(guān)。4.大豆脂肪酸相關(guān)候選基因的時(shí)空表達(dá)分析以LHD2和NHZ開花后30天、40天、50天和60天的種子為材料,采用real-time PCR方法分析2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Gm08DOF-1和Gm20MYB-1,以及4個(gè)關(guān)鍵酶基因FAD2A、FAD3B、FAD2C和FAD3C在種子成熟過程中的時(shí)空表達(dá)模式。LHD2的種子在發(fā)育的50~60天時(shí)2個(gè)飽和脂肪酸硬脂酸和棕櫚酸含量明顯下降,而此時(shí)Gm08DOF-1和Gm20MYB-1的表達(dá)量都明顯上升,由此可見,兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因可能在飽和脂肪酸去飽和過程中發(fā)揮主要作用。同樣我們也檢測了脂肪酸在種子發(fā)育過程中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)FAD3B和FAD2C在NHZ中的表達(dá)量與2個(gè)飽和脂肪酸棕櫚酸和硬脂酸含量呈極顯著正相關(guān),與亞油酸呈極顯著負(fù)相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S565.1;Q943.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2803493