本文關鍵詞：海棠類黃酮合成調控轉錄因子克隆與表達分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：海棠作為園林觀賞植物,在我國已有悠久的栽培歷史。近年來,在育種研究者的不懈努力下,海棠新品種不斷增多,其在葉色、花色、果色、花期、果期、樹形等方面產生了許多變化。在現代園林中,觀賞海棠由于其觀賞特性的極大豐富,逐漸成為了主要的園林造景植物之一。參與植物花色、葉色形成的主要物質之一是植物體內的類黃酮化合物。本實驗通過對紅色葉‘王族’海棠類黃酮合成途徑中的MYB、bHLH、WD40三類轉錄因子的克隆與表達分析,以及對3種不同葉色觀賞海棠的3個時期葉片進行類黃酮含量測定和相關結構基因及轉錄因子的表達水平,對觀賞海棠的葉色形成機制以及調控途徑進行了研究。研究結果如下:(1)選擇紅色葉‘王族’海棠為實驗材料,對其嫩葉中的MYB、bHLH、WD40三類轉錄因子進行克隆,得到MRYMYB10(Gene Bank:KF772789)、MRYMYB6(Gene Bank:KJ026364)、MRYLC(Gene Bank:KP222538)和MRYWD40(Gene Bank:KJ542656)四個基因。對4個基因進行生物信息學分析,發(fā)現其氨基酸序列與蘋果中對應基因MdMYB10(GeneBank:AB592747)、MdMYB6(GeneBank:DQ074461)、MdbHLH33(GeneBank:DQ266451)和MdTTG1(GeneBank:GU173814)的相似度分別為100%、96.79%、98.92%和99.77%。對4個蛋白的二級結構和三級結構分析結果發(fā)現:MRYMYB10蛋白和MRYMYB6蛋白均含有典型的R2R3結構并定位在細胞核,同時MRYMYB10在不同物種間同源性較高,而MRYMYB6與蘋果屬以外的植物同源性很低;MRYLC含有bHLH結構并最有可能定位于細胞核,同時MRYLC在同科內同源性較高,在不同科植物間同源性較低;MRYWD40具有典型的重復WD保守結構,且在不同科屬植物堿的保守性極高,對其進行亞細胞定位發(fā)現其可能存在于細胞骨架,其次是細胞核。(2)選擇紅色葉‘王族’海棠、新葉紅色‘絢麗’海棠和綠色葉‘雪球’海棠的葉片為實驗材料,選取每種海棠的嫩葉期、變色葉期、成熟葉期三個不同時期的葉片進行色素含量分析,結果發(fā)現:1.海棠葉色的紅色著色程度與葉片內的花青苷含量基本呈正相關關系;2.海棠類黃酮合成途徑中不同支路間存在競爭底物、產物積累量此消彼長的關系;3.‘王族’海棠葉片中含有營養(yǎng)價值的部分酚類物質含量不同程度的多余其他兩種海棠同時期葉片,且葉片中各酚類含量與葉片顯紅色的程度基本呈正相關。(3)對3種海棠3個時期葉片中類黃酮合成途徑中相關結構基因和轉錄因子進行表達分析,結果顯示:1.葉片花青苷積累量受ANS和FGT基因調控,但花青苷積累量與ANS基因表達量并不完全一致,而與FGT基因表達量基本一致;2.ANS基因和FGT基因表達量與MRYMYB10、MRYMYB6的相關性顯著。MRYMYB10對花青素積累有正向調節(jié)作用,而MRYMYB6與MRYMYB10為競爭關系,對花青素有負向調節(jié)作用;3.MRYLC與MRYMYB10可能形成復合體,同時對FGT進行調節(jié),從而對花青苷積累起正向調節(jié)作用,而MRYMYB6對MRYLC表達存在抑制作用;4.MRYWD40與MRYLC表達水平基本一致,可能是二者受同一因素調節(jié),也可能是二者形成復合體,相互調節(jié)表達水平;5.MRYWD40與MRYLC形成的復合體可能直接參與花青苷合成調控,也可能與MYB蛋白形成MBW復合體,對花青苷合成進行調控;6.海棠中MRYWD40蛋白可能存在除花青苷合成途徑調控功能以外的其他調控植物生長發(fā)育功能。
【關鍵詞】：觀賞海棠 類黃酮 MYB bHLH WD40 基因克隆 表達分析
【學位授予單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S68;Q943.2
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 第一章 文獻綜述12-24
• 1.1 觀賞海棠研究概述12-13
• 1.1.1 觀賞海棠的生物學特性12
• 1.1.2 觀賞海棠的應用價值12-13
• 1.1.3 觀賞海棠的研究進展13
• 1.2 植物類黃酮研究概述13-18
• 1.2.1 類黃酮13-14
• 1.2.2 類黃酮的主要功能14-16
• 1.2.3 類黃酮在植物體內的生物合成途徑16-18
• 1.3 類黃酮生物合成途徑中調控基因研究概述18-22
• 1.4 本研究的目的和意義22-24
• 第二章 海棠類黃酮合成相關轉錄因子克隆24-52
• 2.1 實驗材料24-25
• 2.1.1 植物材料24
• 2.1.2 主要儀器設備24-25
• 2.1.3 主要試劑藥品25
• 2.2 實驗方法25-32
• 2.2.1 海棠葉片總RNA提取25-26
• 2.2.2 海棠葉片總RNA質量和濃度檢測26
• 2.2.3 反轉錄cDNA第一條鏈合成26-27
• 2.2.4 基因全長引物設計27
• 2.2.5 PCR擴增與檢測27-30
• 2.2.6 基因序列的生物信息學分析30
• 2.2.7 目的基因在‘王族’海棠不同器官中的表達分析30-32
• 2.3 結果與分析32-49
• 2.3.1 海棠葉片總RNA提取與檢測32-33
• 2.3.2 反轉錄cDNA第一條鏈合成與檢測33
• 2.3.3‘王族’海棠MYB10基因的克隆與表達分析33-38
• 2.3.4‘王族’海棠MYB6基因的克隆與表達分析38-41
• 2.3.5‘王族’海棠bHLH基因的克隆與表達分析41-46
• 2.3.6‘王族’海棠WD40基因的克隆與表達分析46-49
• 2.4 討論49-52
• 第三章 海棠葉片色素分析52-60
• 3.1 實驗材料52-53
• 3.1.1 植物材料52-53
• 3.1.2 主要儀器設備53
• 3.1.3 主要試劑藥品53
• 3.2 實驗方法53-54
• 3.2.1 樣品采集與處理53
• 3.2.2 海棠葉片花色苷提取53
• 3.2.3 高效液相色譜儀-二極管陣列檢測器（HPLC-DAD）檢測類黃酮含量53-54
• 3.2.4 數據處理54
• 3.3 結果與分析54-58
• 3.4 討論58-60
• 第四章 海棠葉片類黃酮合成相關基因表達分析60-70
• 4.1 實驗材料60
• 4.1.1 植物材料60
• 4.1.2 主要儀器設備60
• 4.1.3 主要試劑藥品60
• 4.2 實驗方法60-62
• 4.2.1 樣品采集與RNA提取60
• 4.2.2 熒光實時定量引物設計60-61
• 4.2.3 熒光實時定量q-PCR分析與數據處理61-62
• 4.3 結果與分析62-66
• 4.3.1 海棠葉片樣品RNA提取與引物鑒定62
• 4.3.2 結構基因表達分析62-65
• 4.3.3 轉錄因子表達分析65-66
• 4.4 討論66-70
• 第五章 結論70-72
• 參考文獻72-81
• 致謝81-82
• 作者簡介82

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