本文關(guān)鍵詞：西瓜嗜酸菌致病相關(guān)基因的篩選及功能分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：瓜類細(xì)菌性果斑病(bacterial fruit blotch,簡(jiǎn)稱BFB),主要危害西瓜、甜瓜,引起葉斑或葉枯,造成果實(shí)腐爛,導(dǎo)致大量減產(chǎn),嚴(yán)重時(shí)甚至絕收；其病原為西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli),被國(guó)際規(guī)定為檢疫性有害生物之一。然而,目前對(duì)此病菌致病機(jī)制的探究相對(duì)來(lái)說(shuō)較少,因此本研究的主要目標(biāo)是找出以及克隆致病相關(guān)基因,并對(duì)其功能進(jìn)行分析。從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的西瓜嗜酸菌突變體文庫(kù)中活化出1468株突變體作為出發(fā)菌,經(jīng)過(guò)兩輪的西瓜果實(shí)致病性測(cè)定,獲得了215株致病性喪失或明顯下降的突變體；對(duì)1468株突變體進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)131株突變體顏色發(fā)生了變化,160株突變體形態(tài)發(fā)生改變。在西瓜果實(shí)上致病性喪失的127株突變體中,83.5%的突變體顏色發(fā)生改變,85.8%的突變體形態(tài)發(fā)生了變化,然而致病性顯著下降的88株突變體與其顏色和形態(tài)沒(méi)有明顯的相關(guān)性。對(duì)致病力喪失或顯著減弱以及顏色和(或)形態(tài)有變化的50株突變體進(jìn)行甜瓜浸種試驗(yàn),從中挑出16株致病力喪失或減弱的突變體進(jìn)行西瓜摩擦接種試驗(yàn),篩選出11株突變體進(jìn)行亞克隆,得到了9個(gè)相關(guān)基因。利用三親雜交的方法,構(gòu)建其中5個(gè)突變體的互補(bǔ)菌株,這些突變體被插入的基因分別為：1transcriptional regulator AraC family, HrpB; hypothetical protein; DNA-3-methyladenine glycosylase I; L-threonine aldolase; pilus retraction ATPase. PilT。將野生菌A13和3號(hào),5株突變體(195、462、944、X484、X522)以及5株互補(bǔ)菌株(195hb、462hb、944hb、X484hb、X522hb)的過(guò)敏性反應(yīng)、致病性、形態(tài)特征、顏色顯示、生長(zhǎng)能力、群體感應(yīng)信號(hào)、生物膜等進(jìn)行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)互補(bǔ)菌株195hb基本恢復(fù)了過(guò)敏反應(yīng)、致病能力以及生物膜形成能力；菌株944hb恢復(fù)了游動(dòng)能力；菌株X522hb部分恢復(fù)了致病能力；其余互補(bǔ)菌株(462hb、 944hb、X484hb)致病性等表型均沒(méi)有恢復(fù),因此表明了HrpB和PUT基因是與西瓜嗜酸菌致病相關(guān)的基因。
【關(guān)鍵詞】：西瓜嗜酸菌 致病性 亞克隆 三親雜交 生物學(xué)特性
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S436.5
【目錄】：

• 摘要8-9
• Abstract9-11
• 1 前言11-19
• 1.1 BFB的研究簡(jiǎn)況11-15
• 1.1.1 病原菌分類及形態(tài)特征11-12
• 1.1.2 寄主范圍與發(fā)病規(guī)律12-13
• 1.1.3 危害13-14
• 1.1.4 癥狀特點(diǎn)14
• 1.1.5 防治策略14-15
• 1.2 西瓜嗜酸菌致病機(jī)理的研究進(jìn)展15-18
• 1.2.1 Ⅱ型和Ⅲ型分泌系統(tǒng)16
• 1.2.2 群體感應(yīng)系統(tǒng)16-17
• 1.2.3 鞭毛17
• 1.2.4 菌毛17-18
• 1.3 本研究的目的意義18-19
• 2 西瓜嗜酸菌致病性缺失突變體的篩選及Tn5插入位點(diǎn)的鑒定19-36
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料19-20
• 2.1.1 菌株、質(zhì)粒19
• 2.1.2 植物19
• 2.1.3 培養(yǎng)基與試劑19
• 2.1.4 引物19-20
• 2.1.5 主要儀器20
• 2.2 方法20-27
• 2.2.1 菌株的培養(yǎng)20
• 2.2.2 西瓜果實(shí)致病性測(cè)定20-21
• 2.2.3 突變菌株菌落形態(tài)與顏色觀察21
• 2.2.4 甜瓜浸種接種21-22
• 2.2.5 西瓜苗摩擦接種22
• 2.2.6 突變菌株的PCR檢測(cè)22-23
• 2.2.6.1 總DNA的提取22-23
• 2.2.6.2 菌株的PCR擴(kuò)增23
• 2.2.6.3 電泳檢測(cè)23
• 2.2.7 突變體轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的鑒定---亞克隆技術(shù)23-27
• 2.2.7.1 突變體總DNA及pBlue質(zhì)粒DNA的提取23-24
• 2.2.7.2 突變體基因組與質(zhì)粒DNA單酶切24-25
• 2.2.7.3 基因組DNA和pBLue載體酶切產(chǎn)物的回收與連接25-26
• 2.2.7.4 轉(zhuǎn)化26-27
• 2.2.7.4.1 大腸桿菌DH5α熱激感受態(tài)細(xì)胞的準(zhǔn)備26-27
• 2.2.7.4.2 熱激轉(zhuǎn)化27
• 2.2.7.5 轉(zhuǎn)化子的篩選27
• 2.2.7.6 序列分析27
• 2.3 結(jié)果與分析27-35
• 2.3.1 西瓜果實(shí)上突變體致病力篩選結(jié)果27-28
• 2.3.2 突變菌株菌落形態(tài)和顏色的觀察28-29
• 2.3.3 甜瓜種子接種29-31
• 2.3.4 西瓜苗摩擦接種31-32
• 2.3.5 待測(cè)突變菌株的PCR檢測(cè)32
• 2.3.6 突變體Tn5轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的鑒定32-35
• 2.3.6.1 突變菌株總DNA和質(zhì)粒DNA Pst Ⅰ酶切效果32-33
• 2.3.6.2 轉(zhuǎn)化子的獲得33-34
• 2.3.6.3 序列分析34-35
• 2.4 小結(jié)與討論35-36
• 3 西瓜嗜酸菌5個(gè)插入基因的功能鑒定36-56
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料36-39
• 3.1.1 菌株、質(zhì)粒36-37
• 3.1.2 引物37-38
• 3.1.3 植物38
• 3.1.4 培養(yǎng)基38-39
• 3.1.5 主要試劑39
• 3.1.6 主要儀器39
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法39-43
• 3.2.1 菌株的培養(yǎng)39
• 3.2.2 互補(bǔ)菌株的構(gòu)建39-41
• 3.2.2.1 野生菌總DNA的提取39
• 3.2.2.2 PCR擴(kuò)增目的基因39
• 3.2.2.3 重組質(zhì)粒的獲得39-40
• 3.2.2.4 互補(bǔ)質(zhì)粒的構(gòu)建40
• 3.2.2.5 轉(zhuǎn)化-三親雜交的方法40-41
• 3.2.2.6 克隆子驗(yàn)證41
• 3.2.3 過(guò)敏性反應(yīng)測(cè)定41
• 3.2.4 西瓜果實(shí)致病性測(cè)定41
• 3.2.5 甜瓜苗的致病性測(cè)定41
• 3.2.6 西瓜苗的致病性測(cè)定41
• 3.2.7 菌株菌落生長(zhǎng)狀況41-42
• 3.2.8 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定42
• 3.2.9 生物膜的測(cè)定42
• 3.2.10 游動(dòng)性的測(cè)定42
• 3.2.11 群體感應(yīng)測(cè)定42
• 3.2.12 電鏡觀察42-43
• 3.3 結(jié)果與分析43-54
• 3.3.1 互補(bǔ)菌株的構(gòu)建43-47
• 3.3.1.1 PCR擴(kuò)增43
• 3.3.1.2 重組質(zhì)粒的獲得43-44
• 3.3.1.3 測(cè)序分析44-46
• 3.3.1.4 互補(bǔ)菌株的獲得46-47
• 3.3.2 煙草過(guò)敏反應(yīng)47
• 3.3.3 西瓜果實(shí)致病性測(cè)定47
• 3.3.4 甜瓜浸種47-49
• 3.3.5 西瓜苗噴霧接種49-50
• 3.3.6 菌株菌落生長(zhǎng)狀況50
• 3.3.7 生長(zhǎng)曲線測(cè)定50-52
• 3.3.8 生物膜測(cè)定52-53
• 3.3.9 游動(dòng)性測(cè)定53
• 3.3.10 群體感應(yīng)測(cè)定53-54
• 3.3.11 電鏡觀察54
• 3.4 小結(jié)與討論54-56
• 4 結(jié)論與討論56-57
• 4.1 主要結(jié)論56
• 4.2 討論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-62
• 附錄62-66
• 致謝66

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  本文關(guān)鍵詞：西瓜嗜酸菌致病相關(guān)基因的篩選及功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：266721