【摘要】：油菜是我國重要的油料作物之一。進一步提高油酸含量適當降低亞麻酸含量是油菜品質(zhì)改良的重要內(nèi)容,而獲得高油酸和低亞麻酸資源是開展育種工作的基礎(chǔ)。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù),對控制油菜種子中油酸含量的FAD2及亞麻酸含量的FAD3基因進行定點編輯,并通過對轉(zhuǎn)基因后代的連續(xù)自交和回交,獲得了不帶有轉(zhuǎn)基因元件的高油酸低亞麻酸突變體。主要研究結(jié)果如下:1.對甘藍型油菜FAD2與FAD3基因進行生物信息學分析,使用在線軟件篩選出基因編輯靶點,構(gòu)建了對油菜FAD2與FAD3基因靶點特異的CRISPR/Cas9植物表達載體。以農(nóng)桿菌介導的下胚軸轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化油菜品系J9707,獲得了143株轉(zhuǎn)FAD2靶基因和169株轉(zhuǎn)FAD3靶基因轉(zhuǎn)基因油菜。2.通過非變性PAGE膠檢測了所有的轉(zhuǎn)基因陽性植株,并挑選出部分突變單株進行了測序分析。本研究對FAD2靶基因的編輯效率為16%,而對FAD3的編輯效率為5%。FAD2突變體測序與靶基因核酸序列比對表明,單個堿基插入是主要的突變類型,占到各種突變類型的50%以上,同時還發(fā)現(xiàn)有2個至13個堿基缺失的多種突變類型。部分FAD3突變體測序結(jié)果檢測到G-A堿基的替換和2個堿基AC的插入的突變。3.對FAD2基因在2個靶點各個拷貝突變效率進行了比較分析。針對第一個靶位點,BnaA.FAD2.a與BnaC.FAD2.a拷貝的突變效率為分別為53%和29%;而BnaA.FAD2.b與BnaC.FAD2.b拷貝雖然只在靶標序列的第一個堿基處有差異,前者的突變率為18%,BnaC.FAD2.b拷貝未檢測到突變。統(tǒng)計結(jié)果還發(fā)現(xiàn)PAM序列對突變效率有較大影響。在第二個靶點位置,BnaA.FAD2.a拷貝的PAM序列為-GGG,突變效率為71%,然而PAM序列為-NGA的其他拷貝均未出現(xiàn)突變。4.突變單株自交及雜交后代基因型分析表明,雜合突變單株后代基因型的分離比符合孟德爾遺傳規(guī)律。本研究在T0代沒有編輯的陽性單株后代株系中檢測到了突變單株,也觀測到有些在T0代葉片中檢測到突變不存在于種子的后代中;通過回交和自交能有效清除轉(zhuǎn)化植株中的轉(zhuǎn)基因成分。5.分析了轉(zhuǎn)FAD2靶基因的突變單株在T1、T2和T3代種子各種脂肪酸含量。突變體種子中油酸含量顯著提高,最高超過80%(野生型平均為66.43%),而亞麻酸含量顯著下降。突變體中葉片的油酸含量與種子中油酸含量有顯著的正相關(guān)。轉(zhuǎn)FAD3靶基因的突變單株在T2代種子中亞麻酸含量顯著下降。
【圖文】：

利用基因組編輯技術(shù)創(chuàng)造油菜脂肪酸變異新資源在后期要經(jīng)過大量的篩選工作，并且編輯效率沒有明顯的提高（Terada et al 2002）。因此，傳統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)需要大量的人力與物力并且存在一定的安全問題不被人類普遍接受。近年來發(fā)展的人工核酸酶介導的基因組編輯技術(shù)則不同，這種技術(shù)理論上能夠切除任何物種基因組的任何位置，從而能在內(nèi)源性序列上引入特異性修飾。該技術(shù)與傳統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)最大的區(qū)別是能夠?qū)?T-DNA 從轉(zhuǎn)基因受體中分離出來，得到不含轉(zhuǎn)基因成分的突變體（Bassett et al 2013，Zhang et al 2014，Bassett et al 2015）。

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)介導植物定點突變無論是單位點編輯、多位點的刪除及置換都具有高效性和特異性，并且載體構(gòu)建簡便靈活。在農(nóng)，利用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)能夠快速實現(xiàn)基因定點突變和聚合某些優(yōu)良育種提供更有效的方法。油菜脂肪酸改良及脂肪酸相關(guān)基因的研究進展油菜是不僅是我國重要的食用油和高蛋白飼料源，同時也是氫化油最理油菜的脂肪酸改良也主要是從不同的用途展開，，其中最受關(guān)注的一方籽油具有很好的熱穩(wěn)定性，在加熱及存儲過程中不易氧化，可以用來，清潔環(huán)保。油酸還能有效預(yù)防一些動脈硬化等疾病的發(fā)生，對人類要的作用（官春云 2006）。另外，菜籽油中的α-亞麻酸容易發(fā)生氧化產(chǎn)物會使油脂腐敗變質(zhì)并對人體健康產(chǎn)生不利影響（張正麗 2013）。肪酸改良與形成等相關(guān)機理成為了油菜的研究熱點。
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S565.4

【參考文獻】

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1 馬琰巖;李晶哲;高爾寧;錢丹;鐘菊迎;劉長振;;基因編輯技術(shù)的研究進展及其在中藥研究中的前景展望[J];中國中藥雜志;2017年01期

2 景潤春;盧洪;;CRISPR/Cas9基因組定向編輯技術(shù)的發(fā)展與在作物遺傳育種中的應(yīng)用[J];中國農(nóng)業(yè)科學;2016年07期

3 王鵬;淮東欣;蓋江濤;;植物油脂中脂肪酸成分改良的生物技術(shù)研究進展[J];中國油料作物學報;2015年06期

4 馬興亮;劉耀光;;植物CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)與突變分析[J];遺傳;2016年02期

5 高原;周歡敏;;現(xiàn)代基因定點編輯技術(shù)的發(fā)展趨勢[J];內(nèi)蒙古科技與經(jīng)濟;2015年19期

6 李東;左其生;張亞妮;李碧春;;基因組編輯技術(shù)的研究進展[J];畜牧與獸醫(yī);2015年07期

7 趙彥朋;劉峰;李艷軍;朱華國;張新宇;孫杰;;同步抑制FAD2與FatB基因提高煙草種子油酸組分含量的研究[J];西北植物學報;2015年02期

8 王漢中;;我國油菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的歷史回顧與展望[J];中國油料作物學報;2010年02期

9 官梅;李h;官春云;;利用基因芯片技術(shù)研究甘藍型油菜油酸合成中差異表達基因[J];作物學報;2010年06期

10 陳葦;李勁峰;董云松;李根澤;寸守銑;王敬喬;;甘藍型油菜Fad2基因的RNA干擾及無篩選標記高油酸含量轉(zhuǎn)基因油菜新種質(zhì)的獲得[J];植物生理與分子生物學學報;2006年06期

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1 楊慶勇;油菜種子高油酸低亞麻酸的遺傳控制及等位基因特異標記開發(fā)[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2012年

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1 張正麗;油菜隱性核不育基因特異標記開發(fā)及高油酸低亞麻酸核不育系的標記輔助選擇[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2013年

本文編號：2538225