【摘要】：大豆霜霉病是由專性寄生菌Peronospora manhurica(Naoun.)Sydow引起的真菌病害,嚴重威脅大豆生產(chǎn),在世界各大豆產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生,在我國東北和華北地區(qū)的發(fā)生尤其普遍,嚴重年份可減產(chǎn)30%～50%。本實驗室在前期研究中發(fā)現(xiàn),大豆絲氨酸/丙氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶(GmS4GT1)基因的表達與大豆霜霉病抗性密切相關(guān),高抗品種中GmS4GT1的平均表達量是高感品種的13倍,GmSAGT1在轉(zhuǎn)錄水平上參與大豆霜霉病抗性,抗、感品種中GmSAGT1的編碼基因、酶學功能和啟動子均差異微小。GmS4GT1啟動子序列分析發(fā)現(xiàn)有2個轉(zhuǎn)錄因子WRKY的Binding site。已知WRKY是植物的重要轉(zhuǎn)錄因子,在多種植物的抗逆、抗病等生物過程起重要作用。迄今為止,WRKY轉(zhuǎn)錄因子與大豆霜霉病抗性相關(guān)性的研究尚未見文獻報道。為此,本論文對大豆霜霉病抗病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子WRKY進行了篩選和研究,主要成果如下:1.以高抗和高感霜霉病的大豆品種為材料,分別提取接種和未接種霜霉病菌的大豆葉片RNA,進行轉(zhuǎn)錄組測序,分析接種前后WRKYs的表達量,發(fā)現(xiàn)7個WRKYs(WRKY5,WRKYY56,WRKY81,WRKY106,WRKY109,WRKY139 和 WRKY161)差異表達。接種后這7個基因在抗病品種中的表達量均高于感病品種,推測參與調(diào)控GwSA4GT1基因的表達和大豆霜霉病抗性。2.利用實時熒光定量PCR技術(shù),對轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進行驗證發(fā)現(xiàn),7個WRKYs基因在抗感病品種中的表達趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致,證明轉(zhuǎn)錄組測序研究結(jié)果可靠。3.為利用植物體內(nèi)瞬時表達技術(shù)鑒定GwSAGT1啟動子的活性,分別構(gòu)建3個植物表達載體:1)以958bpGwSAGT1全長啟動子G958,驅(qū)動GFP表達的植物表達載體pG958∷GFP;2)以GmS4GT1啟動子3'端355bp核心區(qū)的G355驅(qū)動GFP表達的植物表達載體pG355∷GFP;3)以GmS4GT1啟動子3'端181bp核心區(qū)G181驅(qū)動GFP表達的植物表達載體pG181∷GFP,轉(zhuǎn)入擬南芥原生質(zhì)體中,利用共聚焦激光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),G958∷GFP、G355::GFP和G181∷GFP在擬南芥原生質(zhì)體細胞中均有綠色熒光表達,G958∷GFP的表達最強,G355∷GFP和G181∷GFP的擬南芥原生質(zhì)體細胞中的綠色熒光的亮度相當。表明3種啟動子均具有啟動基因表達的能力,可以用于酵母單雜交研究中誘餌載體的構(gòu)建。4.利用酵母單雜交實驗,對7個WRKYs基因進行篩選,發(fā)現(xiàn)WRKY5,WRKYY56,WRKY106,WRKY109,WRKY1 39和WRKY161均不能與GmSAGT1轉(zhuǎn)錄起始位點上游-235處和-272處的兩個WRKY Bingding site(W-box)互作,WRKY81既能與GmSAGT1轉(zhuǎn)錄起始位點上游的W-boxl(TGACGTAC)結(jié)合也能與W-box2(GACTGAC)結(jié)合,表明WRKY81能夠在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控GmSAGT1的表達,并參與大豆對霜霉病的抗性調(diào)控。本論文首次發(fā)現(xiàn)WRKY在大豆高抗高感中差異表達,與大豆對霜霉病的抗性密切相關(guān),WRKY81通過與GmS4G71啟動子上2個W-box的結(jié)合,調(diào)控大豆的霜霉病抗性。推測大豆受到病原菌刺激后WRKY81表達量首先上調(diào),通過與GmS4GT1啟動子結(jié)合,激活GmSAGT1基因表達,從而提高寄主植物葉片中活性氧含量,誘導超敏反應的發(fā)生,提高大豆對霜霉病的抗性。植物抗病反應是一個極其復雜的反應,它涉及多個網(wǎng)絡和多種機理,本研究對揭示大豆霜霉病抗性的分子機理提供了一個良好的開端,具有重要意義。
【學位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S435.651

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