【摘要】：β-1,4-甘露聚糖酶(β-1,4-D-mannanmann-ohydrolase,EC3.2.1.78),是一類能水解含β-l,4-D-甘露糖糖苷鍵的內(nèi)切水解酶,屬于半纖維素酶類。目前已有大量微生物產(chǎn)生β-甘露聚糖酶的相關(guān)報道,不過這些已經(jīng)被報道的菌株大多是從海洋和土壤中分離得到的。自從邱德有等學(xué)者從云南紅豆杉中分離出能夠合成抗癌藥物紫杉醇的內(nèi)生真菌后,內(nèi)生細(xì)菌的相關(guān)研究持續(xù)升溫,但是主要集中在其藥用價值和拮抗菌的篩選,關(guān)于內(nèi)生細(xì)菌產(chǎn)酶的相關(guān)報道相對較少本研究嘗試從海南特色植物椰果中篩選1-2株高產(chǎn)β-甘露聚糖酶內(nèi)生細(xì)菌,并對其酶學(xué)性質(zhì)、培養(yǎng)條件進行研究,為應(yīng)用于水產(chǎn)動物飼料奠定理論基礎(chǔ)。本研究共從椰果中分離得到56株植物內(nèi)生細(xì)菌。所分離得到的內(nèi)生細(xì)菌分布于5個目,5個科,9個屬,19個種。在分離得到的56株菌中,芽孢芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)共34株,占總菌株數(shù)的60.71%,屬于椰果內(nèi)生細(xì)菌中的優(yōu)勢種群,其次是勒克菌屬(Leclercia sp.)共8株,占總菌株數(shù)的14.29%,第三是嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonas sp.)共5株,占總菌株數(shù)的8.93%。對分離的56株菌進行剛果紅初篩和搖瓶發(fā)酵復(fù)篩發(fā)現(xiàn)菌株YZ-21酶活最高,可以達到20.67 U/mL,確定菌株YZ-21作為研究對象。經(jīng)過測定胞外與胞內(nèi)酶活比為37.97,證明該酶屬于胞外酶。將YZ-21的16S rDNA測序結(jié)果通過NCBI進行BLAST,與Bacillus subtilis subsp.inaquosorum KCTC 13429T相似度為99.93%。YZ-21的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及生理生化指標(biāo)測定等表型鑒定結(jié)果與東秀珠等《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》對枯草芽孢桿菌的描述基本符合,結(jié)合YZ-21的16S rDNA序列比對的結(jié)果,初步將YZ-21菌株鑒定為芽孢桿菌屬細(xì)菌(Paenibacillus sp.)。對菌株YZ-21發(fā)酵條件進行優(yōu)化,得出最優(yōu)培養(yǎng)基為2%瓜豆膠、0.25%蛋白胨、0.2%K2HPO4、0.05%MgSO4、0.5%NaCl。最佳的培養(yǎng)條件為40℃,初始pH值7.0,200 r/min,發(fā)酵72 h,接種量為5%。優(yōu)化過后的產(chǎn)酶水平能達到126.45 U/mL,約為初始酶活的5倍。本研究采用了乙醇沉淀法、硫酸銨鹽析法和雙水相三種方法對YZ-21所產(chǎn)酶進行分離純化,最終確定雙水相的最優(yōu)鹽種類為硫酸銨鹽,16%PEG 2000和18%(NH4)2SO4雙水相體系酶萃取率最高,能達到98.80%,之后添加不同濃度的NaCl,發(fā)現(xiàn)2%NaCl添加量能夠使該酶萃取率上升至99.26%。對該酶的最適溫度、pH進行測定,結(jié)果表明該酶的最適作用溫度為40℃,最適pH為7.0。該酶在55℃條件下保溫2 h之后,相對酶活依然能達到65.7%,在pH 5.0-8.0的條件下,保溫30 min后,相對酶活依然可以保持在80%以上。Mg2+、Ca2+、Co2+、Ba2+、K+這五種離子對于該酶具有激活作用,而酶激活作用最強的則是Ca2+,它能夠使酶活相對于CK組提高了接近63.2%,Cu2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+、Na+和EDTA均表現(xiàn)出了對該酶的抑制作用,其中Cu2+、Zn2+、Mn2+對該酶表現(xiàn)出明顯的抑制作用。對菌株YZ-21基因組DNA進行PCR擴增,得到產(chǎn)β-甘露聚糖酶基因ManA,序列分析表明,該基因全長1127bp,該酶氨基酸序列與相同來源的β-甘露聚糖苷酶同源性最高能夠達到97.56%,具有ManA保守結(jié)構(gòu)域,屬于糖苷水解酶家族GH26的一員。之后構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-manA,將轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE),經(jīng)過誘導(dǎo)獲得了此酶的高效表達。對重組β-甘露聚糖酶酶活進行初步檢測,結(jié)果顯示,酶活力為372.86 U/mL。表達產(chǎn)物經(jīng)過SDS-PAGE凝膠電泳分析,蛋白圖譜顯示一條大約為56.07 KDa的特異性條帶。對重組酶酶學(xué)性質(zhì)進行實驗發(fā)現(xiàn)最適反應(yīng)溫度和pH分別為40℃和pH7.0,對重組β-甘露聚糖酶底物特異性進行實驗,重組β-甘露聚糖酶最佳底物種類是瓜豆膠,其酶活能夠達到392.54U/mL。重組β-甘露聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)研究表明,該菌所產(chǎn)的重組β-甘露聚糖酶最適反應(yīng)溫度和pH分別為40℃和7.0。該酶在35-55℃范圍內(nèi)酶活力較為穩(wěn)定,55℃保溫120 min后,酶活仍保留69.8%;pH 4.0-9.0保溫30 min酶活均可保留60%以上,Ca2+、Co2+對重組β-甘露聚糖酶有明顯的激活作用。
【圖文】：

min 內(nèi)生細(xì)菌生長率最高，能到達 100%，之后迅速下降，在 9 min 時，內(nèi)生細(xì)菌的生長率已經(jīng)降至 0。圖2-1 甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2-1 Standard curve of mannose

充分研磨之后，靜置 5 min，吸取上清進行涂布，觀察是否有內(nèi)生細(xì)菌生長果如圖 2-2 所示。并將分離得到的內(nèi)生細(xì)菌進行純化，記錄菌株形態(tài)特征如。4 內(nèi)生細(xì)菌 16S rDNA 擴增結(jié)果對實驗菌株進行 DNA 提取，，進行 16S rDNA 擴增，之后將擴增產(chǎn)物進行電泳泳結(jié)果如圖 2-3 所示，將條帶單一且亮度較強的產(chǎn)物送至南京金斯瑞公司測序
【學(xué)位授予單位】：河南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S963

【參考文獻】

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本文編號：2538215