【摘要】：青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)是世界十大重要植物病原物之一,因其分布范圍廣、寄主范圍大且具有豐富的種內(nèi)遺傳多樣性而被認(rèn)為是一個(gè)多變的復(fù)合種(species complex)。目前,在我國(guó)青枯雷爾氏菌已有向高緯度高海拔冷涼地區(qū)逐漸蔓延之勢(shì)。全基因組序列的獲得為全面解釋其在寄主識(shí)別、致病力變異、環(huán)境適應(yīng)性以及群體進(jìn)化等方面的特性提供了重要基礎(chǔ)。長(zhǎng)期以來,用于防治由該菌引起的植物青枯病的措施主要包括使用化學(xué)農(nóng)藥、培育抗性品種、生物防治以及農(nóng)業(yè)防治等。由于化學(xué)藥劑防治存在諸多問題,如效果不理想、污染環(huán)境等,目前有很多關(guān)于使用綠色、環(huán)保、有效的天然活性化合物來代替的報(bào)道。但是因該菌在環(huán)境中的多態(tài)性使得迄今為止仍未找到有效的防治藥劑,造成的經(jīng)濟(jì)損失慘重。此外,不同藥劑的長(zhǎng)期使用是否會(huì)影響青枯雷爾氏菌的致病力發(fā)生變化也有待進(jìn)一步研究。本論文在對(duì)代表青枯雷爾氏菌進(jìn)行全基因組測(cè)序的基礎(chǔ)上,分析了該菌株致病因子相關(guān)基因,并進(jìn)一步比較了全國(guó)菌株致病基因變異情況。此外還探究了不同外源物質(zhì)處理對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響及對(duì)致病力的調(diào)控作用,為研究種群多樣性、致病因子變異等與生態(tài)適應(yīng)性的關(guān)系提供基礎(chǔ),為今后青枯病的科學(xué)用藥提供可靠的理論依據(jù)。本研究的主要結(jié)果如下:1.完成了青枯雷爾氏菌菌株CQPS-1的全基因組測(cè)序,并系統(tǒng)分析了致病因子的相關(guān)基因采用單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)(Single molecule real-time sequencing,SMRT)對(duì)青枯雷爾氏菌CQPS-1進(jìn)行全基因組測(cè)序。組裝后得到一條染色體(3.83 Mb)和一個(gè)大質(zhì)粒(2.06 Mb),基因組GC含量為66.84%。共預(yù)測(cè)到5229個(gè)編碼基因,并對(duì)基因進(jìn)行了注釋。將獲得的基因組與菌株GMI1000、YC45、Y45、FQY_4、CFBP2957、PO82、CMR15和PSI07進(jìn)行了比較基因組學(xué)分析,結(jié)果表明,菌株CQPS-1與4株演化型Ⅰ菌株(YC45、FQY_4、Y45、GMI1000)相比,有16個(gè)特有基因家族,共包括基因442個(gè);與其他演化型菌株(CFBP2957、PO82、CMR15、PSI07)相比,有10個(gè)特有基因家族,共包括基因625個(gè)。與GMI1000相比,菌株CQPS-1的III型分泌系統(tǒng)(T3SS)基因簇較為保守,而且除部分III型分泌系統(tǒng)效應(yīng)子基因(如RipAA,RipB和RipG7)存在一定差異外,其他致病相關(guān)基因均較保守。其中,效應(yīng)子基因RipAA出現(xiàn)顯著變異。2.比較了全國(guó)煙草青枯雷爾氏菌的致病因子相關(guān)基因,明確了各個(gè)致病因子相關(guān)基因的變異情況以菌株CQPS-1作為參考基因組,利用HiSeq 4000(Illumina)對(duì)全國(guó)煙草青枯雷爾氏菌的106株代表菌株進(jìn)行基因組重測(cè)序,并分析菌株中致病相關(guān)基因的變異情況。結(jié)果表明,106個(gè)代表菌株基因組與參考菌株CQPS-1基因組比較共有約64,741個(gè)SNP,2,977個(gè)InDel,平均每個(gè)菌株獲得371個(gè)SV變異。所分析的致病因子相關(guān)基因中,Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)子基因相對(duì)于其他類的致病基因,存在更多類型的InDel突變,而與GMI1000相比差異最大的效應(yīng)子基因RipAA的編碼區(qū)域在全國(guó)煙草青枯雷爾氏菌中變異較小,僅存在一個(gè)SNP位點(diǎn)變異。3.測(cè)定了農(nóng)用硫酸鏈霉素及東莨菪內(nèi)酯對(duì)青枯雷爾氏菌的抑制生長(zhǎng)作用和抑菌效果,明確了這些藥劑對(duì)該菌致病力的影響采用平板帶藥法測(cè)定了外源物質(zhì)對(duì)青枯雷爾氏菌的菌落生長(zhǎng)情況,由結(jié)果可知,兩種外源物質(zhì)對(duì)青枯雷爾氏菌菌落的大小均有一定影響。利用濁度法確定了農(nóng)用硫酸鏈霉素及東莨菪內(nèi)酯的IC50分別為0.38 mg/L和133.87 mg/L,然后以此濃度分別制備帶藥培養(yǎng)基,對(duì)青枯雷爾氏菌CQPS-1進(jìn)行長(zhǎng)期的繼代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),觀察其致病力變化情況。通過回接實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),農(nóng)用硫酸鏈霉素繼代培養(yǎng)30次和60次后,菌株的致病力在一定程度上有增強(qiáng)趨勢(shì):培養(yǎng)30次的菌株相較于清水處理菌株致病力有顯著增強(qiáng)的趨勢(shì),繼代培養(yǎng)60次的菌株相較于未處理菌株CQPS-1致病力有顯著增強(qiáng)的趨勢(shì)。而東莨菪內(nèi)酯長(zhǎng)期作用對(duì)菌株的致病力影響規(guī)律不明顯:當(dāng)東莨菪內(nèi)酯繼代培養(yǎng)30次時(shí),雖相較于清水處理有增強(qiáng)的趨勢(shì),但是與溶劑對(duì)照相比無顯著差異;當(dāng)用東莨菪內(nèi)酯繼代培養(yǎng)60次時(shí),與未處理菌株CQPS-1、清水對(duì)照菌株及溶劑對(duì)照菌株均無顯著性差異。4.從分子水平上研究了農(nóng)用硫酸鏈霉素及東莨菪內(nèi)酯長(zhǎng)期脅迫下青枯雷爾氏菌的致病相關(guān)基因的表達(dá)情況在農(nóng)用硫酸鏈霉素長(zhǎng)期處理過程中,菌株的核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子phcA表現(xiàn)出顯著上調(diào)的趨勢(shì),此外,胞外多糖合成相關(guān)基因在處理前期有一定程度的升高,但是處理后期差異不顯著。東莨菪內(nèi)酯處理前期,菌株的Ⅲ型分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)基因hrpG及關(guān)鍵毒力調(diào)節(jié)子基因pehS受到一定影響,而所選取的其他主要致病相關(guān)基因受到的影響不顯著,當(dāng)繼代培養(yǎng)60次時(shí),所有測(cè)定的致病基因變化均不顯著。綜上所述,本研究基于全基因組序列,分析了我國(guó)青枯雷爾氏菌致病相關(guān)基因的差異,發(fā)現(xiàn)了部分出現(xiàn)顯著變異的基因,如RipAA,同時(shí),從全國(guó)菌株致病因子相關(guān)基因的變異情況比較可知,與其他類的致病基因相比,Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)子基因存在更多類型的InDel突變。外源物質(zhì)農(nóng)用硫酸鏈霉素及東莨菪內(nèi)酯處理對(duì)菌株的生長(zhǎng)均有抑制作用;不同外源物質(zhì)長(zhǎng)期脅迫對(duì)菌株致病力及致病基因表達(dá)存在差異。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S432.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2383135