【摘要】：RNAi是由dsRNA觸發(fā)的高度保守的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制,在植物和昆蟲(chóng)中,RNAi是一種主要的抗病毒防御機(jī)制。病毒進(jìn)入宿主后,其復(fù)制過(guò)程中形成的dsRNA在宿主RNA酶ⅢDicer2的作用下,被切割成21-23nt的siRNA,siRNA隨后被組裝到RISC中,引導(dǎo)AGO2切割與其互補(bǔ)配對(duì)的mRNA,從而阻斷病毒的復(fù)制。然而許多植物和動(dòng)物病毒也進(jìn)化出了RNAi的抑制子——VSR,來(lái)抑制宿主的抗病毒途徑。這些VSR都是在病毒感染宿主過(guò)程中起到重要作用的蛋白,但它們?cè)诨蛐蛄泻筒《窘Y(jié)構(gòu)上并不保守,而且在RNAi機(jī)制中的作用位點(diǎn)也不相同。比如,FHV B2蛋白和DCV的1A蛋白可以與dsRNA結(jié)合,阻止dsRNA被識(shí)別及剪切成siRNA。FHV B2蛋白也可以與siRNA結(jié)合,阻止RISC的組裝。而CrPV的1A蛋白、TCV的P38蛋白、poleorviruses的P0蛋白等通過(guò)與AGO2蛋白相互作用,阻止RISC的組裝或作用于RNAi的效應(yīng)階段。而最近的研究發(fā)現(xiàn),與AGO蛋白作用的一部分RNA干擾抑制子,通過(guò)保守的GW/WG motif與AGO蛋白結(jié)合,從而抑制RNAi應(yīng)答。研究稱(chēng),AGO蛋白中發(fā)揮與GW/WG motif結(jié)合功能是PIWI結(jié)構(gòu)域。家蠶核型多角體病毒BmNPV是威脅蠶業(yè)生產(chǎn)的主要病毒,給蠶業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)巨大危害。為了促進(jìn)對(duì)BmNPV的感染機(jī)制的了解,以開(kāi)發(fā)應(yīng)對(duì)之策,本篇研究對(duì)BmNPV能否抑制家蠶的RNAi進(jìn)行了探索,并對(duì)其可能編碼的RNA干擾抑制子進(jìn)行了預(yù)測(cè)以及抑制子功能的鑒定。主要研究結(jié)果如下:1.BmNPV對(duì)BmN4-SID1和BmE細(xì)胞中RNAi的抑制作用的檢測(cè)體外合成兩條針對(duì)螢火蟲(chóng)熒光素酶的雙鏈RNA——dsFluc1和ds Fluc2,將其與雙熒光素酶報(bào)告基因共同轉(zhuǎn)染BmN4-SID1細(xì)胞,對(duì)酶活的測(cè)定結(jié)果顯示,兩條dsRNA均抑制螢火蟲(chóng)熒光素酶的表達(dá),即其均觸發(fā)RNAi機(jī)制。而dsFluc2干涉引發(fā)的RNAi效應(yīng)強(qiáng)于dsFluc1,因此選擇dsFluc2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在未感染的BmN4-SID1細(xì)胞中,dsFluc2干涉引發(fā)的RNAi對(duì)螢火蟲(chóng)熒光素酶的沉默為dsRed的5倍,而在BV病毒感染的細(xì)胞中,這種基因沉默的現(xiàn)象基本得到回復(fù),顯示BmNPV可以抑制家蠶BmN4-SID1細(xì)胞中的RNAi過(guò)程。用dsFluc2與雙熒光素酶報(bào)告基因共同轉(zhuǎn)染BmE細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)其對(duì)螢火蟲(chóng)熒光素酶的干擾為對(duì)照dsRed的27倍。而在BV病毒感染的細(xì)胞中,螢火蟲(chóng)熒光素酶基因的沉默也完全得到了回復(fù),顯示BmNPV同樣可以抑制家蠶BmE細(xì)胞中的RNAi過(guò)程。因此,BmNPV編碼RNAi的抑制子。2.對(duì)BmNPV中潛在的RNA干擾抑制子的預(yù)測(cè)研究用Blastx的方法在TCV、SPMMV和ToRSV的總蛋白中篩選含GW/WG motif的蛋白,分別得到2個(gè)、5個(gè)和5個(gè)含GW/WG motif的蛋白,發(fā)現(xiàn)已報(bào)道的這三個(gè)病毒的VSR-P38、P1和CP蛋白分別位于其中,證明可以用這種方法找出病毒中含GW/WG motif的抑制子。對(duì)BmNPV中含GW/WG motif的蛋白進(jìn)行篩選,共得到16個(gè)蛋白,按照功能不同將其分為四類(lèi):結(jié)構(gòu)蛋白、復(fù)制和表達(dá)相關(guān)蛋白、宿主機(jī)體調(diào)節(jié)蛋白及其他功能蛋白。這些蛋白在病毒DNA的復(fù)制、完整病毒粒子的組裝、病毒進(jìn)入宿主以及子代病毒的釋放等過(guò)程中分別顯示出重要功能。包膜蛋白GP64/67、ODV-E66和衣殼蛋白o(hù)rf1629,38K和VP39是構(gòu)成病毒粒子的主要蛋白,并在蛋白進(jìn)入宿主和出芽過(guò)程中起重要作用。P47,DNA Polymerase和DNA Helicase作用于病毒DNA的復(fù)制,影響病毒增殖。Cystein Protease,Chitinase和p35調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞狀態(tài),病毒在宿主體內(nèi)復(fù)制及組裝完成后,需要借助于前兩者對(duì)宿主機(jī)體的降解和液化來(lái)把釋放子代病毒,而受感染的細(xì)胞為保護(hù)同伴,會(huì)啟動(dòng)“自殺”程序——細(xì)胞凋亡來(lái)阻止病毒大量擴(kuò)增,p35則作用于抑制細(xì)胞凋亡過(guò)程,幫助病毒為所欲為地在宿主體內(nèi)擴(kuò)增,并且研究發(fā)現(xiàn)p35在AcMNPV中的同源基因是RNAi的抑制子。P33、orf4和P48作用于BV增殖、ODV組裝及成熟子代病毒產(chǎn)生,PIF1介導(dǎo)ODV進(jìn)入宿主細(xì)胞膜,P43功能未知。另外,用VSR預(yù)測(cè)網(wǎng)站對(duì)BmNPV的總蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè),篩選出5個(gè)預(yù)測(cè)值最高的蛋白,分別是DNA Polymerase,ODV-E66,以及作用于病毒基因的復(fù)制和表達(dá)過(guò)程的IE-1和LEF-3,包膜蛋白o(hù)rf14。3.抑制子候選基因?qū)NAi的抑制研究及BmAGO2-PIWI domain的表達(dá)本次研究對(duì)預(yù)測(cè)的14個(gè)基因進(jìn)行克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建,分別是BmNPVp35、LEF-3、IE1、GP64、Chitinase、Cystein protease、PIF1、orf1629、P47、P43、P48、orf4和VP39。對(duì)基因進(jìn)行T克隆,測(cè)序驗(yàn)證正確后構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體,雙酶切及測(cè)序驗(yàn)證正確顯示過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建成功,得到pSLfa1180[Hr3-A4-Gene-SV40]。orf14通過(guò)Gateway方法構(gòu)建到pie2FW載體中。向家蠶細(xì)胞中轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)載體,定量PCR檢測(cè)顯示目標(biāo)基因均能在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄表達(dá)。初步選擇9個(gè)候選基因進(jìn)行鑒定,分別是IE1、orf4、P48、p35、LEF-3、orf1629、P47、VP39和P43。同樣借助BmE細(xì)胞中ds Fluc2干涉對(duì)雙熒光素酶報(bào)告基因中螢火蟲(chóng)熒光素酶基因的沉默現(xiàn)象,向細(xì)胞中同時(shí)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)載體,Western Blot檢測(cè)顯示9個(gè)基因均在家蠶細(xì)胞中成功表達(dá)。檢測(cè)其對(duì)螢火蟲(chóng)熒光素酶基因沉默的抑制效果,熒光結(jié)果顯示,orf4、P48、P47和VP39分別造成BmE細(xì)胞中RNAi引發(fā)的沉默值下調(diào)67%、67%、53%和64%,其他基因?qū)NAi沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的抑制效果。由此得出結(jié)論,orf4、P48、P47和VP39發(fā)揮著抑制家蠶RNA silencing效應(yīng)的作用,初步鑒定為BmNPV的干擾抑制子,而其他基因并不發(fā)揮RNAi抑制子的功能。另外,由于一部分含GW/WG motif的RNA干擾抑制子通過(guò)與AGO蛋白的PIWI domain作用發(fā)揮功能,因此我們構(gòu)建了BmAGO2-PIWI domain的原核及真核表達(dá)載體,可用來(lái)進(jìn)行pull-down和免疫沉淀實(shí)驗(yàn)釣取BmNPV中的RNA干擾抑制子。
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【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S884.51

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2382521