【摘要】：近年來,由水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarfvirus,RGDV)引起的水稻瘤矮病在我國廣東、福建、海南省稻區(qū)發(fā)生流行,成為我國南方稻區(qū)的重要病害之一,對水稻產量造成影響。RGDV隸屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)植物呼腸孤病毒屬(Phytoreovirus),主要由介體電光葉蟬以持久增殖方式進行傳播。目前,對RGDV的研究主要集中在基因組結構與功能、寄主及介體細胞內的侵染概況等,關于RGDV在介體電光葉蟬內進行垂直傳播的研究很少。本研究通過預設帶毒情況不同的雌雄電光葉蟬進行群體交配并檢測子代的帶毒率,實驗數據表明,帶毒雌蟲與無毒雄蟲交配時,子代帶毒率為18%左右。然而,當帶毒雄蟲與無毒雌蟲交配時,子代帶毒率可高達到70%左右。明確帶RGDV的雌蟲和雄蟲都能將病毒傳給子代,并且雄蟲在垂直傳播中起重要作用。1、RGDV經雌性垂直傳播本課題組前期通過免疫熒光標記及電鏡觀察,發(fā)現在電光葉蟬雌蟲體內RGDV可能借助非結構蛋白Pnsl1裝配形成的管狀結構進行經卵傳播,但對于其中的機制尚不明確。本研究通過免疫熒光及透射電鏡觀察,推測Pns11管狀結構可能與電光葉蟬肌動蛋白(Actin)相互作用來推動小管克服卵傳屏障。通過雙鏈RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術抑制帶毒電光葉蟬體內Pns11表達,同時設置干擾GFP蛋白表達為對照組。解剖干擾后雌性電光葉蟬的生殖系統(tǒng),通過Western Blot檢測雙鏈RNA干擾對Pns11蛋白表達量的影響。選取干擾效果明顯的批次進行交配實驗,檢測親代個體和子代的帶毒率。結果表明干擾交配的帶毒雌性體內Pns11的表達,子代帶毒率僅為5.3%,與對照組21%相比顯著降低。此外,通過GST pull-down、酵母雙雜交等實驗驗證了 Pns11與電光葉蟬Actin之間存在特異性互作。進一步證實,RGDV侵入電光葉蟬卵細胞可依靠Pns11管狀結構與Actin的相互作用來提供小管穿過濾泡細胞和微絨毛骨架等入卵屏障的動力。2、RGDV經雄性垂直傳播通過群體交配實驗發(fā)現帶毒雄蟲在垂直傳播病毒的過程中起重要的作用。免疫熒光標記和電鏡觀察發(fā)現RGDV病毒粒體主要是粘附于精子的精核表面。實驗室同期研究采用原核表達的RGDV編碼的外殼蛋白(P2、P8)及非結構蛋白Pns11預先體外預孵育健康電光葉蟬精子,然后再進行提純病毒孵育。結果發(fā)現RGDV P8可以體外結合在精核質膜表面。為了探究RGDV P8粘附于精核質膜表面的作用機制,我們用GST pull-down技術從精子可溶性總蛋白中"釣取"與RGDV P8相互作用的精子蛋白。結果從電光葉蟬精子蛋白中"釣取"出與RGDVP8發(fā)生互作的高密度脂蛋白結合蛋白(Vigilin)、硫酸乙酰肝素糖蛋白(HSPG)等十種候選互作蛋白。利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)在Sf9細胞中驗證了 RGDV P8與HSPG及Vigilin蛋白之間確實存在互作。當RGDVP8與HSPG共表達時,二者完全共定位于細胞質膜、細胞質以及核膜周圍。當RGDV P8與Vigilin共表達時,二者均勻的彌散分布在細胞質中并且完全共定位。運用雙分子熒光互補實驗,明確RGDV P8與精子Vigilin及HSPG蛋白可以在本氏煙中互作發(fā)出黃色熒光。通過本氏煙共定位實驗觀察到RGDV P8蛋白與精子的Vigilin主要定位在細胞質膜及細胞骨架上,與HSPG主要定位在細胞質膜上。綜上所述,本研究初步證明RGDV不僅可以通過雌蟲將病毒傳遞給子代,還可以通過雄蟲進行垂直傳播且起到重要的作用。帶毒雌蟲可通過病毒編碼的Pns11與電光葉蟬自身的Actin發(fā)生互作,為包裹病毒粒體的Pns11管狀結構提供突破入卵屏障的動力。帶毒雄蟲垂直傳播RGDV主要是通過病毒編碼的P8蛋白與精核質膜表面的Vigilin及HSPG等蛋白發(fā)生互作,粘附在精子表面隨受精過程進入卵內傳播至子代。因此,本研究對RGDV侵染電光葉蟬卵細胞及借助精子細胞為載體進行垂直傳播的機制進行了初步的研究,為阻斷RGDV垂直傳播提供新的思路和理論依據。
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【學位授予單位】：福建農林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S435.11

【參考文獻】

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本文編號：2342491