【摘要】：家蠶(Bombyx mori L.)屬鱗翅目、蠶蛾科,家蠶核型多角體病毒(BmNPV)病是家蠶飼養(yǎng)過程中最常見、最嚴(yán)重的一類蠶病,造成了蠶桑業(yè)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前,針對家蠶BmNPV病仍然沒有有效的治療方法,其抗病機(jī)制尚不清楚。桑葉是家蠶的主要食物來源,也是一種重要的藥用植物。前期研究發(fā)現(xiàn),桑葉經(jīng)UV-B誘導(dǎo)之后,次生代謝產(chǎn)物的含量發(fā)生變化,其中桑辛素N的含量顯著增加。本文首次發(fā)現(xiàn)飼喂UV-B誘導(dǎo)的桑葉能提高家蠶對于BmNPV病的抗性,并推測桑辛素N是其主要的有效成分。利用label-free技術(shù)對家蠶中腸蛋白進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析,揭示了誘導(dǎo)桑葉及桑辛素N的抗病機(jī)制。研究結(jié)果為家蠶核型多角體病的治療提供了新的方案,也為之后的研究奠定了基礎(chǔ)。此外,對誘導(dǎo)桑葉中桑辛素N的生物合成關(guān)鍵酶進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)桑葉中存在一種新型氧化環(huán)合酶,能催化氧化白藜蘆醇環(huán)合生成桑辛素N的重要前體——桑辛素M。該研究結(jié)果為探討UV-B誘導(dǎo)桑葉中次生代謝產(chǎn)物的變化奠定了基礎(chǔ)。本文的主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:.(1)光酶誘導(dǎo)桑葉中桑辛素N抗BmNPV的機(jī)制研究BmNPV是對家蠶造成危害最大的病毒之一,家蠶在患BmNPV病后期常流出膿汁,內(nèi)含大量的多角體病毒,俗稱膿病。這類疾病造成家蠶死亡,導(dǎo)致了蠶桑業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失。家蠶抗病毒實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)飼養(yǎng)UV-B誘導(dǎo)的桑葉或涂有桑辛素N的桑葉之后,家蠶對BmNPV病的抗性得到提高,感染病毒之后死亡率降低。為了進(jìn)一步研究其抗病機(jī)制,分別取飼喂誘導(dǎo)桑葉(BUM)與桑辛素N(BNM)的家蠶中腸進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析,結(jié)果在BUM組與BNM組中分別鑒定到413和102個差異蛋白。利用生物信息學(xué)進(jìn)一步分析,發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)桑葉和桑辛素N可使較多的核糖體蛋白表達(dá)變化,調(diào)控蛋白的合成、DNA的修復(fù);可以使ATP酶表達(dá)上調(diào)、ATP合成酶表達(dá)下調(diào),以此改變細(xì)胞內(nèi)環(huán)境來阻止病毒脫殼進(jìn)去細(xì)胞核,抵抗病毒的侵染。此外,桑辛素N還可以使細(xì)胞色素氧化酶、Ca2+相關(guān)蛋白與programmed cell death protein表達(dá)上調(diào)從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡,抑制病毒擴(kuò)散與復(fù)制;可以使lipase-1與serine protease precursor表達(dá)上調(diào),來增強(qiáng)家蠶機(jī)體免疫力,抵抗病毒入侵;可以使組蛋白、Rab蛋白表達(dá)上調(diào),前者可與病毒結(jié)合,后者可作為信號分子,在家蠶抗BmNPV過程中起到特殊作用。以上結(jié)果揭示了誘導(dǎo)桑葉和桑辛素N的抗病過程,這對于提高感染BmNPV家蠶的存活率是一個新的治療方案。(2)誘導(dǎo)桑葉中桑辛素N生物合成關(guān)鍵酶的研究桑(Morus alba L.),�？粕�,落葉喬木或灌木,是一種重要的藥用植物,具有多種藥理作用,也是家蠶的主要食物來源。桑辛素是桑葉中重要的次生代謝產(chǎn)物,具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒等活性。桑葉經(jīng)UV-B誘導(dǎo),次生代謝產(chǎn)物的含量發(fā)生變化,其中桑辛素N的含量顯著增加。目前,關(guān)于桑辛素N的化學(xué)合成已經(jīng)有報道,但是其生物合成至今無詳細(xì)的報道。課題組前期研究工作發(fā)現(xiàn)桑辛素N生物合成的重要前體是桑辛素M,本文首次發(fā)現(xiàn)了誘導(dǎo)桑葉中存在一種新型桑辛素氧化環(huán)合酶能催化氧化白藜蘆醇環(huán)合生成桑辛素M,這對于闡明桑辛素N的生物合成具有重要意義。此外,通過酶活反應(yīng),發(fā)現(xiàn)UV-B誘導(dǎo)或暗培養(yǎng)的桑葉中桑辛素氧化環(huán)合酶活性增高。利用單因素實(shí)驗(yàn)、正交實(shí)驗(yàn)對桑辛素氧化環(huán)合酶的提取條件進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果顯示提取液pH為7.5,料液比(g/mL)為1:10,提取液濃度為100mM并添加10mM的Na2-EDTA時,浸提時間為2h,反應(yīng)溫度為30℃時,酶比活力最高。上述研究結(jié)果為之后桑葉氧化環(huán)合酶的分離與純化奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Bombyx Mori L. (Bombyx mori.) belongs to Lepidoptera, Silkworm moth family, and Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus (BmNPV) disease is the most common and serious type of silkworm disease in silkworm rearing, causing enormous economic losses in silkworm industry. Previous studies showed that mulberry leaves induced by UV-B changed the content of secondary metabolites, and the content of morin N increased significantly. It was found for the first time that mulberry leaves induced by UV-B could improve the resistance of silkworm to BmNPV, and it was speculated that Morin N was the main active component. The differential proteomic analysis of midgut proteins of silkworm by label-free technique revealed the mechanism of inducing mulberry leaves and Morin N resistance. The results provided a new treatment scheme for nuclear polyhedrosis of silkworm and laid a foundation for further study. In addition, the key enzymes inducing the biosynthesis of morin N in mulberry leaves were also studied. The results of this study laid a foundation for studying the changes of secondary metabolites in mulberry leaves induced by UV-B. The main contents and results of this paper are as follows: (1) Photoenzyme-induced changes in mulberry leaves. BmNPV is one of the most harmful viruses to silkworm. In the late stage of BmNPV disease, silkworm often exudes pus and contains a large number of polyhedrosis viruses, commonly known as pyosis. These diseases cause death of silkworm and cause huge economic losses in silkworm industry. The experiment of silkworm anti-virus found that feeding UV-B induced mulberry leaves or coating. After mulberry leaves were fed with mulberry leaves containing Morin N, the resistance of silkworm to BmNPV disease was improved and the mortality of Silkworm Infected with BmNPV was decreased. In order to further study the mechanism of resistance, the midgut of silkworm fed with induced mulberry leaves (BUM) and Morin N (BNM) was analyzed by comparative proteomics. The results showed that 413 and 102 differences were identified between BUM and BNM groups, respectively. Protein. Further analysis by bioinformatics showed that inducing mulberry leaves and Morin N could induce more changes in ribosomal protein expression, regulate protein synthesis and DNA repair, up-regulate ATPase expression and down-regulate ATP synthase expression, thus changing the cellular environment to prevent virus shelling into the cell nucleus and resist virus infection. Morin N can also up-regulate the expression of cytochrome oxidase, Ca2+ related protein and programmed cell death protein, thereby promoting cell apoptosis and inhibiting virus proliferation and replication; up-regulate the expression of lipase-1 and serine protease precursor, thereby enhancing the immunity of silkworm and resisting virus invasion; and up-regulate the expression of histone and Rab proteins. The above results reveal the process of inducing resistance of mulberry leaves and Morin N, which is a new therapeutic scheme for improving the survival rate of Silkworm Infected with BmNPV. (2) Study on the key enzyme of inducing Morin N biosynthesis in mulberry leaves. Morus alba L., mulberry, deciduous tree or shrub, is an important medicinal plant, with a variety of pharmacological effects, but also the main source of silkworm food. Morin is an important secondary metabolite in mulberry leaves, with anti-tumor, anti-inflammatory, anti-virus and other activities. At present, the chemical synthesis of morin N has been reported, but the biosynthesis of morin N has not been reported in detail. The important precursor of biosynthesis of morin N was found to be Morin M. A novel Morin oxidative cyclooxygenase was found in the induced mulberry leaves for the first time. It is important to elucidate the biosynthesis of morin N by catalyzing the cyclization of resveratrol to form Morin M. In addition, the activity of morin oxidative cyclase in mulberry leaves induced by UV-B or cultured in dark was increased by enzyme activity reaction. The extraction conditions of morin oxidative cyclase were optimized by single factor experiment and orthogonal experiment. The results showed that the specific activity of the enzyme was the highest when the pH of the extract was 7.5, the ratio of material to liquid was 1:10, the concentration of the extract was 100 mM and the concentration of Na2-EDTA was 10 mM. The results laid a foundation for the isolation and purification of the oxidative cyclooxygenase from mulberry leaves.
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S884.51

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本文編號：2217823