【摘要】：本文旨在研究冷應激條件下miR-210的靶基因,并以大鼠肝臟組織和肝細胞系為研究對象。通過qRT-PCR技術對大鼠肝臟中的miR-210表達量進行了分析,后續(xù)又通過生物信息學的方法,應用TargetScan、miRanda、PicTar和mirDB四種預測軟件對miR-210的靶基因進行了分析。首先在細胞中篩選上調(diào)和下調(diào)miR-210的最佳條件,之后對miR-210的8個靶基因(ISCU、PSMB6、RAD52、GPD1、GPD2、ATP1b1、E2F3和Rap1b)進行篩選,并利用Western Blot技術對后續(xù)蛋白表達進行驗證。根據(jù)細胞試驗篩選出的靶基因,再對大鼠肝臟中的這些靶基因進行驗證。最后對大鼠肝細胞進行凋亡和增殖實驗。結果顯示:大鼠肝臟中miR-210的表達量出現(xiàn)極顯著(P0.01)上調(diào)。在后續(xù)下調(diào)和上調(diào)試驗篩選中發(fā)現(xiàn),最佳上調(diào)條件為細胞培養(yǎng)24 h轉染mimics 100pmol,最佳下調(diào)條件為細胞培養(yǎng)24 h,轉染inhibitor 150pmol。細胞中qRT-PCR結果顯示GPD2、ISCU、PSMB6、RA52和E2F3均在miR-210上調(diào)時出現(xiàn)顯著水平的表達下調(diào),并在miR-210下調(diào)時出現(xiàn)顯著水平的上調(diào),并且其靶蛋白ISCU和PSMB6也有相同趨勢的表達。在大鼠肝細胞系增殖和凋亡的試驗中發(fā)現(xiàn)miR-210的升高會明顯抑制細胞增殖,引起細胞死亡,而miR-210降低并未影響細胞死亡,但是會促進細胞增殖。后續(xù)的大鼠肝臟試驗中又對GPD2、ISCU、PSMB6、RA52和E2F3五個靶基因進行了驗證,發(fā)現(xiàn)ISCU、PSMB6、RA52和E2F3 4個靶基因出現(xiàn)了顯著(P0.05)下調(diào),GPD2并無明顯變化,冷應激大鼠肝臟中的靶蛋白ISCU和PSMB6均出現(xiàn)顯著(P0.05)或極顯著下調(diào)(P0.01)。結論:miR-210的升高可能對冷應激大鼠肝臟造成一定損傷,尤其是影響大鼠肝細胞的增殖和凋亡;降低大鼠的免疫力;并抑制大鼠肝臟中的呼吸鏈電子傳遞;同時也減少了大鼠肝臟在過度動員時產(chǎn)生的氧化損傷。
[Abstract]:The aim of this study was to study the target genes of miR-210 under cold stress and to study the liver tissues and cell lines of rats. The expression of miR-210 in rat liver was analyzed by qRT-PCR technique, and the target genes of miR-210 were analyzed by means of Target ScanmimiRanda PicTar and mirDB. The optimal conditions for up-regulation and down-regulation of miR-210 were first screened in the cells, then the eight target genes of miR-210 (miR-210 PSMB6RAD52GPD1GPD1GPD2ATP-1b1A1E2F3 and Rap1b) were screened, and the subsequent protein expression was verified by Western Blot technique. The target genes in rat liver were screened by cell test. Finally, apoptosis and proliferation of rat hepatocytes were tested. The results showed that the expression of miR-210 in rat liver was significantly up-regulated (P0.01). In the subsequent down-regulation and up-regulation test screening, we found that the best up-regulation condition was that the cells were transfected with mimics 100pmol for 24 h, and the best down-regulation condition was the cell culture for 24h, and the optimal down-regulation condition was that the cells were transfected with inhibitor 150pmol. The results of qRT-PCR showed that both GPD2 / ISCUU PSMB6 RA52 and E2F3 were down-regulated when miR-210 was up-regulated, and significantly up-regulated when miR-210 was down-regulated, and the target proteins ISCU and PSMB6 showed the same trend. In the experiment of proliferation and apoptosis of rat liver cell line, it was found that the increase of miR-210 significantly inhibited cell proliferation and caused cell death, while the decrease of miR-210 did not affect cell death, but promoted cell proliferation. In the subsequent rat liver test, the five target genes of GPD2 / ISCUPSMB6ARA52 and E2F3 were verified. It was found that the four target genes of ISCU PSMB6, RA52 and E2F3 were significantly down-regulated (P0.05) and no significant changes were found in GPD2. The target protein ISCU and PSMB6 in the liver of cold stress rats were significantly (P0.05) or extremely down-regulated (P0.01). Conclusion the increase of miR-210 may damage the liver of cold stress rats, especially affect the proliferation and apoptosis of rat hepatocytes, decrease the immunity of rats, and inhibit the electron transfer of respiratory chain in rat liver. It also reduces the oxidative damage caused by excessive mobilization of the liver in rats.
【學位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.3

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