【摘要】：本文旨在研究冷應(yīng)激條件下miR-210的靶基因,并以大鼠肝臟組織和肝細(xì)胞系為研究對(duì)象。通過(guò)qRT-PCR技術(shù)對(duì)大鼠肝臟中的miR-210表達(dá)量進(jìn)行了分析,后續(xù)又通過(guò)生物信息學(xué)的方法,應(yīng)用TargetScan、miRanda、PicTar和mirDB四種預(yù)測(cè)軟件對(duì)miR-210的靶基因進(jìn)行了分析。首先在細(xì)胞中篩選上調(diào)和下調(diào)miR-210的最佳條件,之后對(duì)miR-210的8個(gè)靶基因(ISCU、PSMB6、RAD52、GPD1、GPD2、ATP1b1、E2F3和Rap1b)進(jìn)行篩選,并利用Western Blot技術(shù)對(duì)后續(xù)蛋白表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)細(xì)胞試驗(yàn)篩選出的靶基因,再對(duì)大鼠肝臟中的這些靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。最后對(duì)大鼠肝細(xì)胞進(jìn)行凋亡和增殖實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示:大鼠肝臟中miR-210的表達(dá)量出現(xiàn)極顯著(P0.01)上調(diào)。在后續(xù)下調(diào)和上調(diào)試驗(yàn)篩選中發(fā)現(xiàn),最佳上調(diào)條件為細(xì)胞培養(yǎng)24 h轉(zhuǎn)染mimics 100pmol,最佳下調(diào)條件為細(xì)胞培養(yǎng)24 h,轉(zhuǎn)染inhibitor 150pmol。細(xì)胞中qRT-PCR結(jié)果顯示GPD2、ISCU、PSMB6、RA52和E2F3均在miR-210上調(diào)時(shí)出現(xiàn)顯著水平的表達(dá)下調(diào),并在miR-210下調(diào)時(shí)出現(xiàn)顯著水平的上調(diào),并且其靶蛋白ISCU和PSMB6也有相同趨勢(shì)的表達(dá)。在大鼠肝細(xì)胞系增殖和凋亡的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)miR-210的升高會(huì)明顯抑制細(xì)胞增殖,引起細(xì)胞死亡,而miR-210降低并未影響細(xì)胞死亡,但是會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖。后續(xù)的大鼠肝臟試驗(yàn)中又對(duì)GPD2、ISCU、PSMB6、RA52和E2F3五個(gè)靶基因進(jìn)行了驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)ISCU、PSMB6、RA52和E2F3 4個(gè)靶基因出現(xiàn)了顯著(P0.05)下調(diào),GPD2并無(wú)明顯變化,冷應(yīng)激大鼠肝臟中的靶蛋白ISCU和PSMB6均出現(xiàn)顯著(P0.05)或極顯著下調(diào)(P0.01)。結(jié)論:miR-210的升高可能對(duì)冷應(yīng)激大鼠肝臟造成一定損傷,尤其是影響大鼠肝細(xì)胞的增殖和凋亡;降低大鼠的免疫力;并抑制大鼠肝臟中的呼吸鏈電子傳遞;同時(shí)也減少了大鼠肝臟在過(guò)度動(dòng)員時(shí)產(chǎn)生的氧化損傷。
[Abstract]:The aim of this study was to study the target genes of miR-210 under cold stress and to study the liver tissues and cell lines of rats. The expression of miR-210 in rat liver was analyzed by qRT-PCR technique, and the target genes of miR-210 were analyzed by means of Target ScanmimiRanda PicTar and mirDB. The optimal conditions for up-regulation and down-regulation of miR-210 were first screened in the cells, then the eight target genes of miR-210 (miR-210 PSMB6RAD52GPD1GPD1GPD2ATP-1b1A1E2F3 and Rap1b) were screened, and the subsequent protein expression was verified by Western Blot technique. The target genes in rat liver were screened by cell test. Finally, apoptosis and proliferation of rat hepatocytes were tested. The results showed that the expression of miR-210 in rat liver was significantly up-regulated (P0.01). In the subsequent down-regulation and up-regulation test screening, we found that the best up-regulation condition was that the cells were transfected with mimics 100pmol for 24 h, and the best down-regulation condition was the cell culture for 24h, and the optimal down-regulation condition was that the cells were transfected with inhibitor 150pmol. The results of qRT-PCR showed that both GPD2 / ISCUU PSMB6 RA52 and E2F3 were down-regulated when miR-210 was up-regulated, and significantly up-regulated when miR-210 was down-regulated, and the target proteins ISCU and PSMB6 showed the same trend. In the experiment of proliferation and apoptosis of rat liver cell line, it was found that the increase of miR-210 significantly inhibited cell proliferation and caused cell death, while the decrease of miR-210 did not affect cell death, but promoted cell proliferation. In the subsequent rat liver test, the five target genes of GPD2 / ISCUPSMB6ARA52 and E2F3 were verified. It was found that the four target genes of ISCU PSMB6, RA52 and E2F3 were significantly down-regulated (P0.05) and no significant changes were found in GPD2. The target protein ISCU and PSMB6 in the liver of cold stress rats were significantly (P0.05) or extremely down-regulated (P0.01). Conclusion the increase of miR-210 may damage the liver of cold stress rats, especially affect the proliferation and apoptosis of rat hepatocytes, decrease the immunity of rats, and inhibit the electron transfer of respiratory chain in rat liver. It also reduces the oxidative damage caused by excessive mobilization of the liver in rats.
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.3

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