【摘要】：實驗一:草魚CTGF基因的全長克隆、生物信息學(xué)分析及組織差異表達CTGF(Connective tissue growth factor)是即結(jié)締組織生長因子,參與細胞增殖、遷移、粘合和細胞外基質(zhì)的形成,在胚胎發(fā)生、血管生成、傷口修復(fù)及纖維化疾病的發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。本實驗采用c DNA末端快速擴增法首次克隆獲得草魚CTGF基因全長序列,對其編碼蛋白質(zhì)序列的特性進行預(yù)測和分析,并采用實時熒光定量PCR法檢測草魚各組織CTGF基因的差異表達。結(jié)果表明,草魚CTGF基因全長2223 bp,所編碼343個氨基酸;草魚CTGF基因編碼的氨基酸序列與團頭魴、斑馬魚、鯉魚、墨西哥脂鯉CTGF的氨基酸序列同源性分別達98%、96%、91%、91%;生物信息學(xué)分析顯示草魚CTGF蛋白分子量為37978.2,理論等電點為8.22,為親水性分泌蛋白,在多肽鏈1-21氨基酸殘基段存在信號肽;其二級結(jié)構(gòu)包括α-螺旋(α-helix)、β-重疊股(β-strand)和環(huán)(loop)。組織差異性表達分析顯示CTGF基因在肌肉、皮膚、肝臟、心臟、腦、鰓、前腸、血液和脾臟均有表達,其中在血液和脾臟中表達量最高,心臟和鰓組織次之,皮膚、肌肉、腎臟、腦和前腸組織表達量較低,肝臟組織中的表達量最低。實驗二:草魚ROCK1基因的全長克隆、生物信息學(xué)分析及組織差異表達ROCK1是Rho激酶(ROCK)家族的成員之一,ROCK家族是Rho蛋白的下游效應(yīng)因子,被Rho蛋白激活后ROCK作用于下游的效應(yīng)分子,對其介導(dǎo)的信號通路進行調(diào)節(jié),參與細胞增殖、遷移、形態(tài)改變等。在組織纖維化、癌癥、心血管等疾病中發(fā)揮著重要作用。本實驗采用c DNA末端快速擴增法首次克隆獲得草魚ROCK1基因全長序列,對其編碼蛋白質(zhì)序列的特性進行預(yù)測和分析,并采用實時熒光定量PCR法檢測草魚各組織ROCK1基因的差異表達。結(jié)果表明,草魚ROCK1基因全長4604 bp,編碼1361個氨基酸;草魚ROCK1基因編碼的氨基酸序列與金線渻、斑馬魚、鯉魚ROCK1的氨基酸序列同源性分別達95%、94%、94%;生物信息學(xué)分析顯示草魚ROCK1蛋白分子量158035.73,理論等電點5.69,為親水性非分泌蛋白,不存在信號肽;其二級結(jié)構(gòu)包括α-螺旋(α-helix)、β-重疊(β-strand)和環(huán)(loop)。組織差異性表達分析顯示ROCK1基因在肌肉、皮膚、肝臟、心臟、腦、鰓、前腸、血液和脾臟均有表達,其中在腦和血液中表達量最高(P0.05),其次為鰓、心臟、腎臟、脾臟和前腸組織,肌肉和肝臟組織表達量較低,皮膚組織表達量最低。實驗三:投飼蠶豆對草魚肌肉和皮膚組織TGFβ1-CTGF信號通路及膠原基因表達的影響本實驗以投喂配合飼料的草魚為對照組,以干蠶豆浸泡24h后投喂的草魚為實驗組(也稱蠶豆組),對兩組魚進行為期12周的養(yǎng)殖,并分別于0周、4周、8周和12周采集肌肉和皮膚組織,采用熒光定量法測定蠶豆組和對照組肌肉和皮膚組織TGFβ1、CTGF、ROCK1、COL1A1及COL1A2基因的時空表達。結(jié)果顯示,蠶豆組皮膚和肌肉組織TGFβ1、CTGF、COL1A1及COL1A2基因4個時期的表達量變化趨勢一致,均在4周達到最高且顯著高于對照組,8周和12周時則顯著降低。蠶豆組肌肉組織ROCK1基因在4周時的表達量達到最高,但4周、8周和12周的表達量均低于對照組,而皮膚組織ROCK1在4周、8周和12周逐漸降低,且均低于對照組。蠶豆確實影響了草魚TGFβ1、CTGF、ROCK1、COL1A1和COL1A2的表達,TGFβ1、CTGF和ROCK1基因參與調(diào)控COL1A1和COL1A2的表達。由結(jié)果推測認為蠶豆飼喂前期可能通過促進TGFβ1-CTGF信號通路刺激TGFβ1、CTGF的高表達,進而促進膠原蛋白的合成;同時蠶豆飼喂后期可能抑制了ROCK1的表達,進而其對TGFβ1-CTGF信號通路的促進作用減弱,表現(xiàn)為后期膠原蛋白合成的降低,相關(guān)分子調(diào)控機制值得進一步深入研究。
[Abstract]:In this experiment , the full - length cloning , bioinformatics analysis and expression of connective tissue growth factor , which are the connective tissue growth factor , are involved in the formation of connective tissue growth factor , involved in cell proliferation , migration , adhesion and extracellular matrix . The results show that the total length of ctgf gene is 37978.2 , the theoretical isoelectric point is 8.22 , and the amino acid sequence identity of grass carp , zebra fish , carp and Mexican fat carp is 98 % , 96 % , 91 % and 91 % , respectively . The results show that the expression of ctgf gene in muscle , skin , liver , heart , brain , gill , anterior intestine , blood and spleen is highest , and the expression of ctgf gene is lower in blood and spleen , and the expression of connective tissue growth factor is lower in the skin , muscle , kidney , brain and foregut tissues . In this experiment , the full - length cloning , bioinformatic analysis and tissue differential expression of grass carp were studied . The results showed that the total length of grass carp was 4604 bp , and the protein sequence identity was 94 % and 94 % . The results showed that the gene of grass carp was cloned from the muscle , skin , liver , heart , brain , gill , anterior intestine , blood and spleen . The results showed that the expression of TGF - 尾1 , ctgf , COL1A1 , COL1A1 and COLI in the muscle and skin of the broad bean group decreased significantly in 4 weeks , 8 weeks and 12 weeks .
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4

【參考文獻】

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本文編號：2130062