【摘要】：禽病毒性疾病如禽傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)一直困擾著養(yǎng)禽業(yè)的健康、快速發(fā)展。化學(xué)藥物對(duì)病毒的抑制效果不明顯,而且還容易產(chǎn)生耐藥性和藥物殘留,新型抗病毒化學(xué)藥物的開(kāi)發(fā)嚴(yán)重滯后;盡管多數(shù)禽類(lèi)病毒性疾病可用疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防,但效果不是都很理想,且在疫苗的使用過(guò)程中,一些免疫力低下的個(gè)體容易誘發(fā)嚴(yán)重的疾病,出現(xiàn)免疫應(yīng)答不平衡等現(xiàn)象。因此,有必要開(kāi)展新型細(xì)胞因子制劑的研究。它可以從增強(qiáng)免疫力,抗病毒活性等多方面達(dá)到預(yù)期的效果。已證明,雞白細(xì)胞介素18(Chicken interleukin-18,ChIL-18)和雞干擾素γ(Chicken interferon,ChIFN-γ)對(duì)多種病毒感染具有抑制作用。因此,有必要研究重組蛋白ChIL-18和ChIFN-γ以及二者混合后的抗病毒效果及其作用機(jī)制。本研究首先對(duì)ChIL-18和ChIFN-γ的全蛋白基因進(jìn)行分析,設(shè)計(jì)引物后分別擴(kuò)增ChIL-18和ChIFN-γ基因并將該基因插入pET28a原核表達(dá)載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)ChIL-18和ChIFN-γ蛋白,經(jīng)純化后進(jìn)行生物活性檢測(cè)。為了鑒定ChIL-18和ChIFN-γ蛋白的抗病毒活性,我們將200 ng/ml ChIL-18和ChIFN-γ分別或共同接種到雞胚胎成纖維細(xì)胞中。24小時(shí)后,用2.5 MOI的IBDV感染雞胚成纖維細(xì)胞。結(jié)果表明,聯(lián)合組的抗病毒效果優(yōu)于ChIL-18或ChIFN-γ組。為了研究蛋白在雞體內(nèi)的抗病毒效果,我們將200μg ChIL-18和ChIFN-γ分別或共同注射14日齡雛雞,同時(shí)用PBS作陰性對(duì)照,24小時(shí)后再次注射,1天后對(duì)雛雞進(jìn)行7×104PFU的IBDV攻毒,檢測(cè)雞法氏囊組織的病毒復(fù)制水平以及病理變化。結(jié)果表明,ChIL-18和ChIFN-γ可以抵抗IBDV,特別是共同作用組的IBDV增殖受到明顯的抑制,表明混合組具有更好的抗病毒效果。蛋白注射雛雞后7天內(nèi),應(yīng)用試劑盒檢測(cè)蛋白在體外刺激脾臟淋巴細(xì)胞增殖及其分泌的細(xì)胞因子和體內(nèi)血清中細(xì)胞因子的變化情況。結(jié)果表明,混合組蛋白可促進(jìn)雞脾臟淋巴細(xì)胞增殖并分泌高水平IL-6,IL-12及IL-17,與PBS組比差異極顯著,而IL-4和IL-10的水平變化不大,血清中的細(xì)胞因子變化情況與淋巴細(xì)胞中相似。表明混合組誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫作用優(yōu)于ChIL-18和ChIFN-γ組。利用雞外周血巨噬細(xì)胞分析ChIL-18和ChIFN-γ對(duì)細(xì)胞內(nèi)幾種Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)及下游信號(hào)通路、主要組織相容性復(fù)合物(majorhistocompatibility complex,MHC)、NO的影響,結(jié)果混合組蛋白可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中TLR2、TLR 3、TLR 4和MHC-II的表達(dá)量升高,MAPK和NFκB信號(hào)通路被激活,NO的分泌水平顯著升高,這些結(jié)果表明混合組蛋白具有更好的抗病毒能力。綜上結(jié)果表明,ChIL-18和ChIFN-γ以及二者協(xié)同可誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)病毒感染產(chǎn)生有效的防御作用,為新型細(xì)胞因子制劑的研究提供參考。
[Abstract]:Avian viral diseases such as infectious bursal disease (IBD) have been puzzling the healthy and rapid development of poultry industry. The inhibitory effect of chemical drugs on virus is not obvious, and it is easy to produce drug resistance and drug residues. The development of new antiviral chemical drugs is seriously delayed; although most avian viral diseases can be immunized with vaccines, However, the effect is not very good, and in the use of vaccine, some individuals with low immunity are prone to induce serious diseases, such as imbalance of immune response. Therefore, it is necessary to develop new cytokine preparations. It can enhance immunity, antiviral activity and other aspects to achieve the desired results. It has been proved that Chicken Interleukin-18 (ChIL-18) and Chicken Interferon- 緯 (ChIFN- 緯) can inhibit the infection of many viruses. Therefore, it is necessary to study the antiviral effect and mechanism of recombinant protein ChIL-18 and ChIFN- 緯. ChIL-18 and ChIFN- 緯 genes were amplified by primer design and inserted into prokaryotic expression vector pET28a to construct recombinant plasmid. The plasmid was transformed into Escherichia coli BL21 and induced by IPTG to express ChIL-18 and ChIFN- 緯 proteins. In order to identify the antiviral activity of ChIL-18 and ChIFN- 緯 proteins, we inoculated 200 ng/ml ChIL-18 and ChIFN- 緯 into chicken embryonic fibroblasts for .24 hours, then infected chicken embryonic fibroblasts with 2.5 moi IBDV. The results showed that the antiviral effect of the combined group was better than that of the ChIL-18 or ChIFN- 緯 group. In order to study the antiviral effect of ChIL-18 and ChIFN- 緯, 200 渭 g ChIL-18 and ChIFN- 緯 were injected into 14-day-old chicks, respectively, and PBS was used as negative control for 24 hours. The viral replication and pathological changes in the bursa of chicken were detected. The results showed that ChIL-18 and ChIFN- 緯 could resist the proliferation of IBDV, especially in the co-acting group, which indicated that the mixed group had better antiviral effect. The proliferation and secretion of cytokines and cytokines in serum of spleen lymphocytes stimulated by protein in vitro were detected by kit within 7 days after injection of chicken protein. The results showed that the mixed histone could promote the proliferation and secretion of IL-6, IL-12 and IL-17 in spleen lymphocytes, which was significantly different from that in PBS group, but the levels of IL-4 and IL-10 did not change. The changes of cytokines in serum were similar to those in lymphocytes. The results showed that the cellular immunity induced by the mixed group was better than that of the ChIL-18 and ChIFN- 緯 groups. The effects of ChIL-18 and ChIFN- 緯 on several Toll-like receptors (TLRs) and their downstream signaling pathways, majorhistocompatibility complexes (MHCs) and nitric oxide (no) in chicken peripheral blood macrophages were analyzed. Results the mixed histone could induce the expression of TLR2TLR3TLR4 and MHC-II in macrophages. The MAPK and NF 魏 B signaling pathway were activated to increase the level of no secretion. These results indicated that the mixed histone had better antiviral ability. The results show that ChIL-18, ChIFN- 緯 and their synergism can induce effective defense against virus infection, and provide a reference for the study of novel cytokines.
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 孫軍;;淺談原核表達(dá)的技巧[J];大學(xué)時(shí)代;2006年07期

2 金元昌;李景鵬;李會(huì)東;周建紅;;重組促性腺激素釋放激素基因原核表達(dá)的影響因素[J];湘潭師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2006年02期

3 韓鈺;王艷林;;小鼠精胺氧化酶的原核表達(dá)與鑒定[J];生物技術(shù)通訊;2007年01期

4 朱向前;楊靜;丁曉然;王升啟;;重組人磷脂爬行酶1的原核表達(dá)及純化[J];生物技術(shù)通訊;2011年06期

5 哲名家;張淼濤;云濤;王玢tx;劉光清;;兔巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆與原核表達(dá)[J];西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2012年04期

6 謝海燕,郭霄峰;豬α-干擾素的原核表達(dá)[J];華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2004年04期

7 孫東波;馮力;劉杰;時(shí)洪艷;佟有恩;劉勝旺;童光志;;豬傳染性胃腸炎病毒n基因的原核表達(dá)及重組蛋白的免疫活性分析[J];病毒學(xué)報(bào);2006年02期

8 孫軍;王俊杰;秦波;伏秀青;高倩倩;王興智;朱筱娟;;粘著斑激酶的原核表達(dá)、純化及抗體的制備[J];分子科學(xué)學(xué)報(bào);2007年02期

9 戴華;鄭佳玉;陳俊華;潘志明;焦新安;;雞α干擾素基因的原核表達(dá)及其活性測(cè)定[J];中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2009年10期

10 湯承;張兆敏;岳華;;雞熱休克蛋白70基因的克隆及原核表達(dá)[J];西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2011年03期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 馬文濤;閆若潛;吳志明;劉光輝;盛敏;謝彩華;;豬白細(xì)胞介素-6的原核表達(dá)及其生物學(xué)活性研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2010年學(xué)術(shù)年會(huì)——第二屆中國(guó)獸醫(yī)臨床大會(huì)論文集(下冊(cè))[C];2010年

2 丁夢(mèng)蝶;魯?shù)?王紅寧;田浪;陽(yáng)泰;張毅;樊汶樵;郭自成;;禽傳染性支氣管炎病毒多基因串聯(lián)表位抗原的原核表達(dá)研究[A];四川省動(dòng)物學(xué)會(huì)第九次會(huì)員代表大會(huì)暨第十屆學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2011年

3 林海波;張桂紅;詹國(guó)英;廖明;任濤;羅開(kāi)健;曹偉勝;徐成剛;辛朝安;;豬白細(xì)胞介素-6基因的非融合原核表達(dá)研究[A];第一屆中國(guó)養(yǎng)豬生產(chǎn)和疾病控制技術(shù)大會(huì)——2005中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2005年

4 隋桂琴;左玲;王桂云;;人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的原核表達(dá)[A];中國(guó)眼底病論壇·全國(guó)眼底病專(zhuān)題學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2008年

5 黃斯勇;梁英民;韓驊;李國(guó)輝;伍艷蘭;康志杰;何飛;張萍;徐恒;劉利;;人Detla-like4ext-93-217原核表達(dá)、純化及蛋白活性檢測(cè)[A];第12屆全國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文摘要[C];2009年

6 張紅;劉志國(guó);屈伸;;人源受體相關(guān)蛋白的原核表達(dá)優(yōu)化及功能檢測(cè)[A];湖北省暨武漢生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會(huì)第八屆會(huì)員代表大會(huì)和第十五次學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要匯編[C];2004年

7 袁志棟;王志亮;劉雨田;吳曉東;劉海生;;水貂朊蛋白前體基因的克隆與原核表達(dá)[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)分會(huì)暨中國(guó)免疫學(xué)會(huì)獸醫(yī)免疫分會(huì)第六次研討會(huì)論文集[C];2005年

8 王士友;張耀洲;;一個(gè)新的家蠶基因的克隆、原核表達(dá)及純化[A];華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會(huì)2006年學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集[C];2006年

9 伍艷蘭;黃斯勇;牛曉麗;張麗;陳茹菲;何飛;張萍;梁英民;劉利;;人Delta-like4ext-93-217原核表達(dá)、純化及蛋白活性檢測(cè)[A];第12屆全國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文摘要[C];2009年

10 馬文濤;閆若潛;吳志明;劉光輝;盛敏;謝彩華;;豬白細(xì)胞介素-6的原核表達(dá)及其生物學(xué)活性研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物傳染病學(xué)分會(huì)第四次豬病防控學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前8條

1 張曉鳴;人IL-16的原核表達(dá)與其功能的初步研究[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（上海生命科學(xué)研究院）;2000年

2 曹秀利;楊樹(shù)PtCDD基因的原核表達(dá)及酶活分析[D];南京林業(yè)大學(xué);2008年

3 黃新河;小鼠TAp63γ的原核表達(dá)、純化、結(jié)構(gòu)及功能初步研究[D];四川大學(xué);2007年

4 張大鵬;VP60蛋白的原核表達(dá)、抗體制備及VP60基因轉(zhuǎn)化的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2012年

5 張少斌;豌豆肌動(dòng)蛋白異型體（PEAc1）的原核表達(dá)及其藻熒光探針的研制[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

6 尹國(guó)華;利用Red重組系統(tǒng)構(gòu)建dsRNA原核表達(dá)體系抗煙草花葉病毒的研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

7 韓凌霞;豬圓環(huán)病毒2型基因的原核表達(dá)與單克隆抗體的制備及感染性分子克隆的動(dòng)物接種試驗(yàn)[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2003年

8 于揚(yáng);重組人源GPx4及其模擬物的原核表達(dá)、結(jié)構(gòu)與功能的研究[D];吉林大學(xué);2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 周鵬;結(jié)核分枝桿菌特異性蛋白的原核表達(dá)、純化及免疫原性分析[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

2 高小磊;六種結(jié)核分枝桿菌特異性抗原的原核表達(dá)及16 KD-38 KD和Ag85A血清學(xué)診斷效果的研究[D];蘭州大學(xué);2015年

3 彭傳林;家蠅抗真菌肽MAF-1原核表達(dá)體系優(yōu)化與活性分析[D];貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院;2015年

4 鐘樹(shù)懷;豬囊尾蚴膜聯(lián)蛋白的原核表達(dá)及其免疫反應(yīng)性分析[D];貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院;2015年

5 孫明潭;豬繁殖與呼吸綜合征病毒河北地方株ORF7基因的原核表達(dá)及ELISA方法的建立[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

6 張良斌;天祝白牦牛KAP家族基因克隆、原核表達(dá)及其在皮膚中的表達(dá)分析[D];西北民族大學(xué);2015年

7 達(dá)小強(qiáng);牦牛轉(zhuǎn)鐵蛋白基因克隆與原核表達(dá)[D];西北民族大學(xué);2015年

8 高翠娥;飛蝗2個(gè)CYP450轉(zhuǎn)基因果蠅品系對(duì)殺蟲(chóng)劑的敏感性及原核表達(dá)[D];山西大學(xué);2015年

9 吳雨航;布氏桿菌病間接ELISA方法的建立及吉林省梅花鹿主要養(yǎng)殖地區(qū)鹿布病血清學(xué)調(diào)查[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

10 姜旭;百合無(wú)癥病毒16kDα基因的克隆、原核表達(dá)及亞細(xì)胞定位[D];大連理工大學(xué);2015年

，

本文編號(hào)：2124326