【摘要】：禽病毒性疾病如禽傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)一直困擾著養(yǎng)禽業(yè)的健康、快速發(fā)展。化學(xué)藥物對病毒的抑制效果不明顯,而且還容易產(chǎn)生耐藥性和藥物殘留,新型抗病毒化學(xué)藥物的開發(fā)嚴重滯后;盡管多數(shù)禽類病毒性疾病可用疫苗進行免疫預(yù)防,但效果不是都很理想,且在疫苗的使用過程中,一些免疫力低下的個體容易誘發(fā)嚴重的疾病,出現(xiàn)免疫應(yīng)答不平衡等現(xiàn)象。因此,有必要開展新型細胞因子制劑的研究。它可以從增強免疫力,抗病毒活性等多方面達到預(yù)期的效果。已證明,雞白細胞介素18(Chicken interleukin-18,ChIL-18)和雞干擾素γ(Chicken interferon,ChIFN-γ)對多種病毒感染具有抑制作用。因此,有必要研究重組蛋白ChIL-18和ChIFN-γ以及二者混合后的抗病毒效果及其作用機制。本研究首先對ChIL-18和ChIFN-γ的全蛋白基因進行分析,設(shè)計引物后分別擴增ChIL-18和ChIFN-γ基因并將該基因插入pET28a原核表達載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達ChIL-18和ChIFN-γ蛋白,經(jīng)純化后進行生物活性檢測。為了鑒定ChIL-18和ChIFN-γ蛋白的抗病毒活性,我們將200 ng/ml ChIL-18和ChIFN-γ分別或共同接種到雞胚胎成纖維細胞中。24小時后,用2.5 MOI的IBDV感染雞胚成纖維細胞。結(jié)果表明,聯(lián)合組的抗病毒效果優(yōu)于ChIL-18或ChIFN-γ組。為了研究蛋白在雞體內(nèi)的抗病毒效果,我們將200μg ChIL-18和ChIFN-γ分別或共同注射14日齡雛雞,同時用PBS作陰性對照,24小時后再次注射,1天后對雛雞進行7×104PFU的IBDV攻毒,檢測雞法氏囊組織的病毒復(fù)制水平以及病理變化。結(jié)果表明,ChIL-18和ChIFN-γ可以抵抗IBDV,特別是共同作用組的IBDV增殖受到明顯的抑制,表明混合組具有更好的抗病毒效果。蛋白注射雛雞后7天內(nèi),應(yīng)用試劑盒檢測蛋白在體外刺激脾臟淋巴細胞增殖及其分泌的細胞因子和體內(nèi)血清中細胞因子的變化情況。結(jié)果表明,混合組蛋白可促進雞脾臟淋巴細胞增殖并分泌高水平IL-6,IL-12及IL-17,與PBS組比差異極顯著,而IL-4和IL-10的水平變化不大,血清中的細胞因子變化情況與淋巴細胞中相似。表明混合組誘導(dǎo)的細胞免疫作用優(yōu)于ChIL-18和ChIFN-γ組。利用雞外周血巨噬細胞分析ChIL-18和ChIFN-γ對細胞內(nèi)幾種Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)及下游信號通路、主要組織相容性復(fù)合物(majorhistocompatibility complex,MHC)、NO的影響,結(jié)果混合組蛋白可以誘導(dǎo)巨噬細胞中TLR2、TLR 3、TLR 4和MHC-II的表達量升高,MAPK和NFκB信號通路被激活,NO的分泌水平顯著升高,這些結(jié)果表明混合組蛋白具有更好的抗病毒能力。綜上結(jié)果表明,ChIL-18和ChIFN-γ以及二者協(xié)同可誘導(dǎo)機體對病毒感染產(chǎn)生有效的防御作用,為新型細胞因子制劑的研究提供參考。
[Abstract]:Avian viral diseases such as infectious bursal disease (IBD) have been puzzling the healthy and rapid development of poultry industry. The inhibitory effect of chemical drugs on virus is not obvious, and it is easy to produce drug resistance and drug residues. The development of new antiviral chemical drugs is seriously delayed; although most avian viral diseases can be immunized with vaccines, However, the effect is not very good, and in the use of vaccine, some individuals with low immunity are prone to induce serious diseases, such as imbalance of immune response. Therefore, it is necessary to develop new cytokine preparations. It can enhance immunity, antiviral activity and other aspects to achieve the desired results. It has been proved that Chicken Interleukin-18 (ChIL-18) and Chicken Interferon- 緯 (ChIFN- 緯) can inhibit the infection of many viruses. Therefore, it is necessary to study the antiviral effect and mechanism of recombinant protein ChIL-18 and ChIFN- 緯. ChIL-18 and ChIFN- 緯 genes were amplified by primer design and inserted into prokaryotic expression vector pET28a to construct recombinant plasmid. The plasmid was transformed into Escherichia coli BL21 and induced by IPTG to express ChIL-18 and ChIFN- 緯 proteins. In order to identify the antiviral activity of ChIL-18 and ChIFN- 緯 proteins, we inoculated 200 ng/ml ChIL-18 and ChIFN- 緯 into chicken embryonic fibroblasts for .24 hours, then infected chicken embryonic fibroblasts with 2.5 moi IBDV. The results showed that the antiviral effect of the combined group was better than that of the ChIL-18 or ChIFN- 緯 group. In order to study the antiviral effect of ChIL-18 and ChIFN- 緯, 200 渭 g ChIL-18 and ChIFN- 緯 were injected into 14-day-old chicks, respectively, and PBS was used as negative control for 24 hours. The viral replication and pathological changes in the bursa of chicken were detected. The results showed that ChIL-18 and ChIFN- 緯 could resist the proliferation of IBDV, especially in the co-acting group, which indicated that the mixed group had better antiviral effect. The proliferation and secretion of cytokines and cytokines in serum of spleen lymphocytes stimulated by protein in vitro were detected by kit within 7 days after injection of chicken protein. The results showed that the mixed histone could promote the proliferation and secretion of IL-6, IL-12 and IL-17 in spleen lymphocytes, which was significantly different from that in PBS group, but the levels of IL-4 and IL-10 did not change. The changes of cytokines in serum were similar to those in lymphocytes. The results showed that the cellular immunity induced by the mixed group was better than that of the ChIL-18 and ChIFN- 緯 groups. The effects of ChIL-18 and ChIFN- 緯 on several Toll-like receptors (TLRs) and their downstream signaling pathways, majorhistocompatibility complexes (MHCs) and nitric oxide (no) in chicken peripheral blood macrophages were analyzed. Results the mixed histone could induce the expression of TLR2TLR3TLR4 and MHC-II in macrophages. The MAPK and NF 魏 B signaling pathway were activated to increase the level of no secretion. These results indicated that the mixed histone had better antiviral ability. The results show that ChIL-18, ChIFN- 緯 and their synergism can induce effective defense against virus infection, and provide a reference for the study of novel cytokines.
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.65

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本文編號：2124326