本文選題：金鐵鎖關(guān)鍵酶基因的克隆生物信息學(xué)分析釀酒酵母工程菌的構(gòu)建 + ��； 參考：《云南中醫(yī)學(xué)院》2017年碩士論文

【摘要】：中藥材金鐵鎖來源于石竹科金鐵鎖屬植物金鐵鎖Psammosilene tunicoides W.C.Wu et C.Y.Wu的干燥根,首載于《滇南本草》,主要用于治療風(fēng)濕痛,跌打損傷等。金鐵鎖的藥用活性成分為齊墩果烷型三萜總皂苷類物質(zhì)[1,2],此類物質(zhì)主要從金鐵鎖植物的根中提取,但隨著長期過度采挖野生資源,而人工種植中存在品種退化、人力成本等問題[3,4],金鐵鎖的活性成分已不能滿足市場需求,亟需提供新的資源途徑。在課題組前期研究基礎(chǔ)上,本課題進(jìn)行金鐵鎖三萜皂苷下游合成途徑中關(guān)鍵酶基因UGT(糖基轉(zhuǎn)移酶家族基因)的初步克隆鑒定。同時(shí)構(gòu)建產(chǎn)beta-香樹素的酵母工程菌,為直接生產(chǎn)有效成分或中間體奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1.通過轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù),克隆獲得兩條金鐵鎖糖基轉(zhuǎn)移酶基因的全長序列。經(jīng)生物信息學(xué)分析后分別命名為UGT71G1、PtT1。其中UGT71G1的序列全長為1402bp,包含一條為1107 bp的完整開放閱讀框,共編碼了368個(gè)氨基酸,預(yù)測相對分子質(zhì)量為41.05KD,在155位到336位置處存在高度保守UDPGT結(jié)構(gòu)功能域,經(jīng)過多重序列比對后發(fā)現(xiàn)與香石竹、人參等具有較高的同源性。PtT1全長1529bp,ORF為1377bp,編碼458個(gè)氨基酸,相對分子質(zhì)量為51.25KD,與同科植物香石竹糖基轉(zhuǎn)移酶基因DcT227具有很高的同源性。2.構(gòu)建UGT71G1、PtT1、UGT1的原核表達(dá)體系,發(fā)現(xiàn)UGT71G1及UGT1兩條基因的表達(dá)蛋白與理論蛋白大小一致,表示原核表達(dá)成功。采用實(shí)時(shí)熒光定量檢測方法對UGT1的相對表達(dá)量進(jìn)行分析,顯示該基因在葉中的相對表達(dá)量較高。3.利用酶切連接技術(shù)將β-香樹素合成酶基因與pYES2表達(dá)載體進(jìn)行連接,并轉(zhuǎn)入釀酒酵母細(xì)胞中構(gòu)建異源表達(dá)工程菌,經(jīng)分子鑒定結(jié)果顯示β-香樹素合成酶基因能異源表達(dá)具有活性功能的蛋白酶。本課題從金鐵鎖糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆鑒定入手,對兩個(gè)可能參與到三萜皂苷合成途徑的糖基轉(zhuǎn)移酶基因進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析;成功構(gòu)建了金鐵鎖UGT71G1和UGT1的原核表達(dá)體系;進(jìn)行了β-香樹素酵母工程菌的構(gòu)建等工作。完善了金鐵鎖三萜皂苷合成途徑的研究,為下一步基因的功能研究奠定了基礎(chǔ),同時(shí)也為今后利用合成生物學(xué)技術(shù)快速大量生產(chǎn)金鐵鎖有效成分提供基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。
[Abstract]:The traditional Chinese medicine Jintiesin comes from the dry root of Psammosilene tunicoides W.C.Wu et C.Y.Wu, a plant of the genus Psammosilene tunicoides W.C.Wu et C.Y.Wu, which is mainly used in the treatment of rheumatism and injury. The medicinal active component of Jintiezao is oleane-type triterpenoid total saponins. This kind of substance is mainly extracted from the roots of the plant. However, with the long-term overexploitation of wild resources, there are varieties degeneration in artificial cultivation. The active components of gold and iron lock can not meet the market demand, so it is urgent to provide a new resource way. On the basis of the previous study, the key enzyme gene UGT (glycosyltransferase family) gene in the downstream synthesis pathway of triterpenoid saponins was cloned and identified. At the same time, yeast engineering bacteria producing beta-vanillin were constructed, which laid the foundation for direct production of active components or intermediates. The main results are as follows: 1. Based on the transcriptional data, the full length sequences of two gold and iron lock-glycosyltransferase genes were cloned. After bioinformatics analysis, they were named UGT71G1PtT1. The total length of UGT71G1 is 1402bp. it contains a complete open reading frame of 1107 BP, encoding 368 amino acids. The predicted molecular weight is 41.05KD. there is a highly conserved domain of UDPGT structure at the 155-336 position. After multiple sequence alignment, it was found that there was a high homology with carnation, ginseng and so on. The ORF of 1529bp was 1377bp, encoding 458 amino acids, and the relative molecular weight was 51.25kD. it had high homology with carnation glycosyltransferase gene DcT227 of the same family plant. The prokaryotic expression system of UGT71G1PtT1 and UGT1 was constructed. It was found that the expressed proteins of UGT71G1 and UGT1 were the same as the theoretical proteins, indicating that the prokaryotic expression was successful. The relative expression of UGT1 was analyzed by real-time fluorescence quantitative detection. The results showed that the relative expression of the gene in leaves was high. 3. 尾 -vanillin synthase gene was ligated with pYES2 expression vector by restriction endonuclease ligation technique, and then transformed into Saccharomyces cerevisiae cells to construct heterologous expression engineering bacteria. The results of molecular identification showed that 尾 -vanillin synthase gene was able to express protease with active function. In this paper, two glycosyltransferase genes which may be involved in the synthesis of triterpenoid saponins were cloned and analyzed by bioinformatics. The prokaryotic expression systems of UGT71G1 and UGT1 were successfully constructed, and the 尾 -vanillin yeast engineering bacteria were constructed. The study on the synthetic pathway of the triterpenoid saponins was improved, which laid a foundation for the further study of the function of the gene, and also provided the basis and scientific basis for the rapid production of the active components of the gold and iron locks by the synthetic biological technology in the future.
【學(xué)位授予單位】：云南中醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S567.239

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本文編號(hào)：1938857