本文選題：PCV2 + Cap蛋白��； 參考：《鄭州大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：豬圓環(huán)病毒Ⅱ型(Porcine circovirus,PCV2)是引起豬圓環(huán)病毒病(Porcine circovirus disease,PCVD)的主要病原,它能損害患病仔豬的免疫系統(tǒng),引發(fā)其他多種病原混合感染或繼發(fā)性感染,導(dǎo)致豬的繁殖能力嚴(yán)重下降,給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PCV2感染的早期診斷對(duì)PCVD的綜合防控具有重大意義。目前,針對(duì)PCV2病原的快速檢測(cè)方法主要有膠體金免疫層析試紙法和ELISA檢測(cè)方法等,其所用抗體主要是基于雜交瘤細(xì)胞制備的單克隆抗體,傳統(tǒng)單克隆抗體存在生產(chǎn)周期長(zhǎng)、成本高、穩(wěn)定性差等缺點(diǎn),在一定程度上限制了PCV2快速、高效、廉價(jià)的檢測(cè)方法的研制。而基因工程方法制備的單鏈抗體具有生產(chǎn)周期短,成本低、易于改造等優(yōu)點(diǎn),其有望取代傳統(tǒng)單抗用于PCV2新型免疫學(xué)檢測(cè)方法的研制。實(shí)驗(yàn)的主要內(nèi)容與結(jié)果如下:1.PCV2 Cap蛋白的純化及鑒定本實(shí)驗(yàn)將重組表達(dá)載體pET28a-ORF2轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中,用IPTG誘導(dǎo)表達(dá),利用Ni-NTA親和層析法對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化,并對(duì)蛋白進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示表達(dá)的重組蛋白分子量約26 kDa,主要以可溶形式存在,且能被His單克隆抗體特異性識(shí)別,純化后的重組蛋白純度比較高。用此蛋白免疫BALB/C鼠,免疫后,經(jīng)ELISA檢測(cè),測(cè)得鼠血清中抗體滴度達(dá)1∶64000,同時(shí)用PCV2抗體檢測(cè)試紙對(duì)鼠血清進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果為陽性。本實(shí)驗(yàn)制備的重組Cap蛋白具有可溶性好、純度高、免疫原性好等特點(diǎn),為Cap蛋白單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建提供了必要的實(shí)驗(yàn)材料。2.PCV2 Cap蛋白噬菌體單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建及淘選選取免疫效果較好的小鼠脾臟,提取其脾臟總RNA,再以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板,PCR擴(kuò)增抗體的重鏈可變區(qū)基因(Heavy chain variable region of antibody,VH)和抗體的輕鏈可變區(qū)基因(Light chain variable region of antibody,VL),經(jīng)重疊PCR將VH與VL用多肽(G4S)3連接,獲得單鏈抗體基因(Single chain antibody variable region gene fragment,ScFv)。經(jīng)輔助噬菌體輔助侵染后獲得噬菌體單鏈抗體庫(kù),用Cap蛋白作為包被原篩選PCV2單鏈抗體克隆,獲得3株與Cap蛋白特異性反應(yīng)的噬菌體克隆。取特異性及反應(yīng)性相對(duì)較高的克隆測(cè)序,獲得PCV2單鏈抗體基因,并用ELISA鑒定ScFv-P18菌株的誘導(dǎo)表達(dá)后粗提物,結(jié)果顯示獲得的粗提物能與Cap蛋白發(fā)生反應(yīng)。本研究表達(dá)并純化到了可溶性PCV2 Cap蛋白,并構(gòu)建PCV2 Cap蛋白噬菌體單鏈抗體庫(kù),篩選到具有結(jié)合活性的特異性單鏈抗體,其有望用于PCV2新型快速檢測(cè)方法的研制。
[Abstract]:Porcine circovirus type 2 (Porcine circovirus) is the main pathogen causing porcine circovirus disease (PCVD2). It can damage the immune system of infected piglets and lead to mixed or secondary infection of many other pathogens, leading to a serious decline in the reproductive ability of pigs. The early diagnosis of PCV2 infection is of great significance to the comprehensive prevention and control of PCVD. At present, the main methods for rapid detection of PCV2 pathogens are colloidal gold immunochromatographic test paper method and ELISA detection method. The antibodies used are mainly based on monoclonal antibodies prepared by hybridoma cells, and the traditional monoclonal antibodies have long production cycle. The disadvantages of high cost and poor stability limit the development of fast, efficient and cheap detection method for PCV2. However, the single-chain antibody prepared by genetic engineering method has the advantages of short production cycle, low cost and easy modification. It is expected to replace the traditional monoclonal antibody for the development of a new immunological detection method for PCV2. The main contents and results are as follows: 1. Purification and identification of PCV2 Cap protein. In this experiment, the recombinant expression vector pET28a-ORF2 was transferred into Escherichia coli BL21 and expressed by IPTG. The target protein was purified by Ni-NTA affinity chromatography, and the protein was identified. The results showed that the molecular weight of the expressed recombinant protein was about 26 kDa, which existed mainly in soluble form and could be specifically recognized by His monoclonal antibody. The purified recombinant protein was of high purity. BALB/C mice were immunized with this protein. The titer of antibody in the serum of mice was 1: 64000 by ELISA detection. The serum of mice was detected with PCV2 antibody test paper and the results were positive. The recombinant Cap protein prepared in this experiment has the characteristics of good solubility, high purity and good immunogenicity. The necessary materials for the construction of Cap single chain antibody library were provided. 2. The construction of phage single chain antibody library of PCV2 Cap protein and the selection of mouse spleen with better immune effect by panning. The spleen total RNAs were extracted, and the heavy chain variable region of antibody VHs were amplified by reverse transcription cDNA template. The heavy chain variable region of antibody VHs and the light chain variable region of antibody VHs were amplified by overlapping PCR. VH and VL were linked with polypeptide G4Sf3 by overlapping PCR. Single chain antibody variable region gene fragment was obtained. The phage scFv library was obtained after assisted phage infection. PCV2 scFv clones were screened with Cap protein as the coating, and three phage clones specifically reacted with Cap protein were obtained. The PCV2 single chain antibody gene was obtained by cloning and sequencing, and the crude extract of ScFv-P18 strain was identified by ELISA. The results showed that the obtained crude extract could react with Cap protein. In this study, soluble PCV2 Cap protein was expressed and purified, and PCV2 Cap phage scFv library was constructed, and specific scFv with binding activity was screened, which is expected to be used in the development of a new rapid detection method for PCV2.
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.651

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本文編號(hào)：1895228