發(fā)布時間：2018-04-30 09:52

  本文選題：弓形蟲 + GRA17��； 參考：《山東農(nóng)業(yè)大學》2017年碩士論文

【摘要】：弓形蟲病(Toxoplasmosis)是一種由弓形蟲感染引起的重要的人獸共患的寄生蟲病。弓形蟲可以感染幾乎所有的溫血動物(包括人),人類弓形蟲的感染率達到了三分之一左右,弓形蟲病傳染性很強,并且流行也非常廣泛。目前尚無穩(wěn)定、安全、有效的弓形蟲疫苗可用,因而研發(fā)高效的新型疫苗成為防控弓形蟲病的首要任務。隨著現(xiàn)代生物技術不斷的創(chuàng)新和提高,弓形蟲的基因疫苗作為可能用于預防弓形蟲病的重要方式之一,其相關研究也越來越引起人們的重視。基因疫苗具有免疫保護力強、免疫持久、穩(wěn)定性好、制備簡單、生產(chǎn)成本低等諸多優(yōu)點。弓形蟲的致密顆粒蛋白是由顆粒細胞器分泌的一類免疫活性蛋白,它們在弓形蟲的細胞內(nèi)生長發(fā)育過程中起著至關重要的作用,是重要的疫苗候選分子。有關研究表明,弓形蟲GRA17基因的缺失能夠使蟲體喪失毒力,這為我們對GRA17和GRA23基因的核酸疫苗及GRA17基因缺失株弱毒苗的研究奠定了基礎。本研究旨在構建弓形蟲GRA17基因的DNA疫苗及GRA17基因缺失株弱毒苗,評價其抗弓形蟲的免疫保護力。利用RT-PCR技術從RH株弓形蟲速殖子總RNA中擴增得到弓形蟲TgGRA17和TgGRA23基因,構建了真核表達質(zhì)粒pVAX-GRA17和pVAX-GRA23;然后將質(zhì)粒瞬時轉染到HEK 293-T細胞中,并對基因在細胞中的表達情況進行鑒定分析。利用重組質(zhì)粒pVAX-GRA17、pVAX-GRA23及pVAX-GRA17+pVAX-GRA23的混合疫苗組對BABL/c小鼠先后進行三次免疫,以空質(zhì)粒pVAX1作為對照;在第3次免疫之后2w和每次免疫之前收集小鼠血清,利用ELISA方法對小鼠血清中的Ig G抗體水平進行檢測。在第三次免疫2 w后,每組取3只小鼠,將小鼠安樂死之后取脾臟,制備脾淋巴細胞懸液;利用CCK-8法對脾淋巴細胞增殖能力進行檢測,用流式細胞術檢測CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞百分比。利用弓形蟲速殖子抗原(STAg)刺激小鼠脾細胞,通過ELISA檢測試劑盒對脾細胞因子進行檢測。三次免疫之后,對小鼠進行攻蟲實驗,評價基因疫苗對小鼠的免疫保護力。利用CRISPR/Cas9技術在Ⅰ型RH蟲株中敲除了GRA17基因,成功構建RHΔGRA17蟲株,并利用RHΔGRA17蟲株感染昆明小鼠,分別在免疫28 d和70 d之后收集小鼠血清,利用ELISA方法對小鼠血清中的Ig G抗體水平進行檢測。并在免疫70 d之后每組取三只小鼠安樂死之后取脾臟,制備脾淋巴細胞懸液,利用弓形蟲速殖子抗原刺激小鼠脾細胞,通過ELISA檢測試劑盒對脾細胞因子進行檢測。在免疫70 d后對小鼠進行攻蟲實驗,評價RHΔGRA17蟲株對小鼠的免疫保護力。GRA17和GRA23基因疫苗實驗結果顯示,疫苗免疫組IgG抗體水平隨著時間延長而逐漸升高,且混合基因疫苗組的抗體水平高于單基因疫苗組。脾淋巴細胞增殖實驗與流式細胞術檢測結果顯示,pVAX-GRA17、pVAX-GRA23和pVAX-GRA17+pVAX-GRA23混合疫苗免疫組的SI值分別為1.24±0.13,1.54±0.11,1.57±0.085;CD4+T細胞百分比分別為21.49±1.68,21.23±3.89,20.34±1.88;CD8+T細胞百分比分別為6.66±1.02,7.63±1.24,8.20±0.97。與對照組相比以上數(shù)據(jù)都有一定程度的升高。經(jīng)致死性RH株弓形蟲感染后,pVAX-GRA17、pVAX-GRA23及pVAX-GRA17+pVAX-GRA23的混合疫苗組小鼠存活時間分為9.1±0.32 d、10.8±0.79 d和12.6±2.55 d,與對照組相比均有明顯增長。說明pVAX-GRA17、pVAX-GRA23和pVAX-GRA17+pVAX-GRA23能夠誘導小鼠產(chǎn)生一定水平的體液免疫和細胞免疫反應,并對弓形蟲感染產(chǎn)生了一定程度的免疫保護力,且混合疫苗與單基因疫苗相比具有更好的免疫保護效果。RHΔGRA17蟲株弱毒苗研究結果顯示,RHΔGRA17弱毒蟲株能夠誘導機體產(chǎn)生相應的細胞免疫應答和體液免疫應答。弓形蟲急性感染試驗中,空白對照組小鼠感染弓形蟲RH、PYS和TgC7蟲株后,小鼠再感染10 d之內(nèi)全部死亡;而經(jīng)RHΔGRA17蟲株免疫的小鼠能感染弓形蟲RH、PYS和TgC7株速殖子后,35 d之內(nèi)均無死亡現(xiàn)象。弓形蟲慢性感染試驗中,空白對照組感染弓形蟲PRU株包囊后,小鼠在感染35 d后僅有40%的小鼠存活,且存活小鼠的腦包囊鼠為4296±687個/只;而經(jīng)RHΔGRA17弱毒苗免疫的小鼠分別感染弓形蟲PRU株包囊后,小鼠在感染35 d之內(nèi)均無死亡現(xiàn)象,且存活小鼠的腦包囊鼠為53±15個/只。以上結果表明,RHΔGRA17蟲株具有良好的免疫原性,并且能夠誘導小鼠在對抗弓形蟲對小鼠的急性感染和慢性感染時產(chǎn)生較好免疫保護力。
[Abstract]:Toxoplasmosis ( Toxoplasmosis ) is a kind of immune active protein secreted by Toxoplasma gondii , which is a kind of immune active protein secreted by granular organelle . Compared with the control group , mice infected with Toxoplasma gondii RH , PYS and TgC7 were significantly higher than those in the control group .

【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.4

【參考文獻】

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本文編號：1824080