本文選題：ELF4(E74-like + factor��； 參考：《華中農(nóng)業(yè)大學》2017年碩士論文

【摘要】：天然免疫系統(tǒng)是機體抵御病原微生物侵入的重要屏障,也是機體獲得適應性免疫反應的基礎(chǔ)。I型干擾素(IFN-I)的產(chǎn)生和分泌是天然免疫應答的一個很重要的方面,其主要包括IFN-α和IFN-β。本課題將豬抗病毒天然免疫信號通路作為切入點,克隆了該通路中的關(guān)鍵分子E74樣因子4(po ELF4)基因,并對其在IFN-β信號通路中的功能進行了深入研究。主要研究內(nèi)容如下:1.豬ELF4基因的克隆、序列分析及組織表達差異分析以提取的PK-15 RNA反轉(zhuǎn)錄的c DNA為模板,首次克隆得到了po ELF4基因,該基因開放讀碼框全長為1989bp,編碼662個氨基酸。同源序列比對發(fā)現(xiàn)po ELF4與人ELF4(hu ELF4)基因同源性高達91.57%,與鼠ELF4的同源性為78.58%。進化樹分析表明po ELF4在進化上單獨屬于一個分支。組織表達差異顯示po ELF4在豬胃、小腸和淋巴中的表達量比較高,并以小腸中的表達量最高。2.豬ELF4參與激活I(lǐng)FN-β信號通路抗病毒天然免疫信號通路中的許多關(guān)鍵分子參與激活I(lǐng)FN-β信號通路。將po ELF4真核表達質(zhì)粒分別與豬源IFN-β啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒IFN-β-luc、豬源IRF3熒光素酶報告質(zhì)粒IRF3-luc以及內(nèi)參質(zhì)粒海參熒光素酶報告質(zhì)粒p RL-TK共轉(zhuǎn)染至豬小腸粘膜上皮細胞(SIEC)、豬腎細胞(PK-15)、豬腎上皮細胞(IBRS-2),雙熒光素酶檢測顯示po ELF4能顯著激活I(lǐng)FN-β-luc和IRF3-luc,并呈現(xiàn)劑量依賴。核定位實驗表明,超表達po ELF4不能促進IRF3入核。3.豬ELF4激活I(lǐng)FN-β的功能域分析根據(jù)軟件預測po ELF4有8個結(jié)構(gòu)域,因而構(gòu)建了8個缺失突變體。雙熒光素酶實驗顯示分別缺失NLS、ETS、53-86(Acidic domain)和T2B區(qū)域以后,po ELF4激活I(lǐng)FN-β的能力下降,而缺失其它區(qū)域沒有影響,說明NLS、ETS、53-86(Acidic domain)和T2B區(qū)域是豬ELF4激活I(lǐng)FN-β的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。有文獻報道hu ELF4缺失360-347(Serine/threonine rich domain)區(qū)域后不能誘導干擾素產(chǎn)生,主要是因為該區(qū)域缺失后hu ELF4不能被磷酸化,進而不能入核。核定位實驗顯示po ELF4缺失NLS區(qū)域后定位于細胞漿,而缺失306-347(Serine/threonine rich domain)區(qū)域后依然能夠入核,提示其可能存在其它的磷酸化位點。4.豬ELF4參與Se V、poly(I:C)、poly(d A:d T)誘導的IFN-β產(chǎn)生以po ELF4的干擾分子轉(zhuǎn)染PK-15細胞,利用IFN-β啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒檢測了內(nèi)源性po ELF4對Se V、poly(I:C)、poly(d A:d T)誘導的IFN-β產(chǎn)生的影響,結(jié)果顯示干擾內(nèi)源性po ELF4后顯著抑制由Se V、poly(I:C)、poly(d A:d T)誘導的IFN-β產(chǎn)生,并呈劑量依賴性,說明po ELF4參與Se V、poly(I:C)、poly(d A:d T)誘導的IFN-β產(chǎn)生。5.豬ELF4對病毒增殖的影響及病毒感染對豬ELF4表達的影響為了分析po ELF4對病毒增殖的影響,以PRV和PRRSV分別作為DNA病毒和RNA病毒的代表,在細胞中超表達或干擾po ELF4,通過TCID50檢測或結(jié)合PFU檢測、熒光定量PCR和Western blot檢測,證實po ELF4對PRV和PRRSV增殖有顯著的抑制作用。此外,在體外細胞培養(yǎng)中,PRRSV感染、Se V感染及poly(I:C)和poly(d A:d T)刺激均能夠促進po ELF4的表達,但PRV感染對po ELF4的表達影響不顯著。
[Abstract]:The expression of IFN - 尾 - luc in pig stomach , pig kidney cells ( PK - 15 ) , porcine kidney epithelial cells ( IBRS - 2 ) were studied . IFN - 尾 induced by Se V , poly ( I : C ) and poly ( d A : d T ) was detected by using IFN - 尾 promoter luciferase reporter plasmid . In vitro cell culture , the infection , Se V infection and poly ( I : C ) and poly ( d A : d T ) stimulated the expression of po ELF4 , but the effect of PRV infection on the expression of po ELF4 was not significant .

【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.4

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號：1788087