本文選題：桔小實蠅　切入點(diǎn)：肽聚糖識別蛋白　出處：《西南大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：先天免疫系統(tǒng)是昆蟲抵御病原物入侵的主要防御系統(tǒng),昆蟲先天免疫包括體液免疫和細(xì)胞免疫。體液免疫主要以產(chǎn)生抗菌肽、凝集素、溶菌酶和蛋白酶抑制劑等方式發(fā)揮作用,而細(xì)胞免疫則是通過細(xì)胞吞噬和包被發(fā)揮作用。昆蟲先天免疫系統(tǒng)主要依賴Toll和Imd兩個信號通路行使功能。Toll信號通路主要參與對革蘭氏陽性細(xì)菌的免疫過程,而Imd則主要參與對革蘭氏陰性細(xì)菌的免疫過程。肽聚糖識別蛋白(Peptidoglycan Recognition Proteins,PGRPs)在這兩個免疫通路中有著至關(guān)重要的作用,是昆蟲免疫系統(tǒng)中的第一道防線。對PGRPs的研究有助于進(jìn)一步了解昆蟲的免疫反應(yīng)過程,能夠為基于免疫信號通路的害蟲防控技術(shù)的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。本學(xué)位論文以果蔬重要害蟲桔小實蠅(Bactrocera dorsalis)為研究對象,利用基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫對桔小實蠅PGRPs進(jìn)行全面挖掘和鑒定;利用熒光定量PCR技術(shù),分析PGRPs在桔小實蠅不同發(fā)育階段的表達(dá)模式;采用顯微注射和RT-qPCR技術(shù),檢測病原物誘導(dǎo)后PGRPs的表達(dá)變化;最后利用RNAi技術(shù),干擾PGRP-LC并測定桔小實蠅對細(xì)菌敏感性的變化,初步發(fā)現(xiàn)了PGRP-LC在桔小實蠅免疫中的功能。本研究旨在為深入開展桔小實蠅PGRPs研究奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1.桔小實蠅PGRPs的鑒定與序列分析基于桔小實蠅基因數(shù)據(jù)庫和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),鑒定了12個桔小實蠅PGRPs。其中,有5條PGRPs基因存在可變剪切現(xiàn)象,PGRP-LA、PGRP-LB、PGRP-LC、PGRP-LD、PGRP-SC分別有2個、2個、4個、3個和2個剪切子。尤以PGRP-LC的剪切方式最為復(fù)雜。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),桔小實蠅PGRPs與橄欖實蠅和地中海實蠅PGRPs親緣關(guān)系最近。對桔小實蠅PGRPs功能域C端氨基酸比對,發(fā)現(xiàn)多個保守的氨基酸殘基,推測PGRP-LB、-SB1/2、-SC2、-SC2b、-NSB1和-SC等都具有酰胺酶活性;除PGRP-SA、PGRP-SCb和PGRP-NSC2外,其它PGRPs均含有Arg位點(diǎn),可能參與對二氨基庚二酸型肽聚糖(Pepridoglycan from Gram-negative bacteria,DAP-PGN)的識別。2.桔小實蠅PGRPs不同發(fā)育階段的表達(dá)模式桔小實蠅PGRPs在不同發(fā)育階段的mRNA表達(dá)水平存在差異,表明在桔小實蠅生長過程中發(fā)揮的功能不同。其中,PGRP-LA、PGRP-LB和PGRP-LC在桔小實蠅整個變態(tài)過程中均高量表達(dá),而PGRP-LE、PGRP-SB1/2和PGRP-SC2/2b均在幼蟲期和成蟲期高表達(dá)。結(jié)合對果蠅PGRP-SC2的研究結(jié)果,推測桔小實蠅PGRP-SC2和PGRP-SC2b可能對腸道微生物具有調(diào)控作用。PGRP-SA在桔小實蠅各個發(fā)育階段均有表達(dá),PGRP-SD主要在成蟲期高表達(dá),而PGRP-SCa的表達(dá)無明顯規(guī)律。3.桔小實蠅PGRPs在病原因子誘導(dǎo)后的表達(dá)變化利用顯微注射和熒光定量PCR技術(shù),分析桔小實蠅PGRPs在E.coli、PGN-EB(Pepridoglycan from E.coli O111:B4)和PGN-SA(Pepridoglycan from Staphylococcus aureus)誘導(dǎo)后表達(dá)變化。結(jié)果顯示,在注射E.coli和PGN-EB后,PGRP-LAa、PGRP-LB、PGRP-SC2和PGRP-SC2b表達(dá)受到抑制,推測這些基因在桔小實蠅體內(nèi)可能是Imd信號通路的負(fù)調(diào)控因子;而PGRP-LE表達(dá)上調(diào),推測PGRP-LE可能參與對革蘭氏陰性細(xì)菌的識別。在注射PGN-SA后,PGRP-LE的表達(dá)受到抑制,推測PGRP-LE可能不參與對PGN-SA的識別。PGRP-SA、PGRP-SD、PGRP-SB1和PGRP-SB2的表達(dá)在注射病原物誘導(dǎo)后均上調(diào),說明它們可能參與到對兩類細(xì)菌的識別過程。4.桔小實蠅PGRP-LC的功能分析采用熒光定量PCR技術(shù)分析桔小實蠅PGRP-LC的4個剪切子在不同組織中表達(dá)模式,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這4個剪切子主要在成蟲中腸和脂肪體高水平表達(dá)。飼喂抗生素后,桔小實蠅PGRP-LCa、PGRP-LCb和PGRP-LCc的表達(dá)量發(fā)生顯著變化,其中PGRP-LCa表達(dá)顯著下調(diào),PGRP-LCb和PGRP-LCc的表達(dá)則顯著上調(diào),PGRP-LCd的表達(dá)沒發(fā)生顯著變化。4個剪切子均在E.coli和PGN-EB誘導(dǎo)后顯著上調(diào),尤其以PGRP-LCd上調(diào)的倍數(shù)最高。在白僵菌誘導(dǎo)后,PGRP-LCc和PGRP-LCd顯著下調(diào);在PGN-SA誘導(dǎo)后,PGRP-LCb和PGRP-LCd顯著下調(diào)。不同的剪切子表達(dá)量的變化說明各自參與的免疫過程存在差異,其中PGRP-LCa參與的免疫過程更廣泛,PGRP-LCd的免疫特異性更強(qiáng)。在對3條剪切子基因有效干擾后,再注射E.coli后分析桔小實蠅的存活率,結(jié)果顯示注射桔小實蠅實蠅的存活率明顯下降,說明降低PGRP-LCa、PGRP-LCc和PGRP-LCd的表達(dá),增加了桔小實蠅對E.coli的敏感性。同時降低3個剪切子的表達(dá),使得桔小實蠅對E.coli更加敏感。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S433

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1726796