本文選題：馬鈴薯Y病毒　切入點(diǎn)：復(fù)制酶　出處：《山東農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：馬鈴薯Y病毒脈壞死株系(PVY~N)和馬鈴薯Y病毒普通株系(PVY~O)是馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)的兩個(gè)主要株系,侵染煙草后分別會(huì)引發(fā)系統(tǒng)脈壞死和系統(tǒng)性斑駁的癥狀。amiRNA(artificial microRNA,amiRNA)和 siRNA(small interfering RNA,siRNA)是兩種類(lèi)型的沉默介導(dǎo)因子。這兩類(lèi)小RNA(sRNA),近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于植物抗病毒研究。本研究以PVY~O的復(fù)制酶基因NIb的兩個(gè)區(qū)域作為靶序列,分別設(shè)計(jì)siRNA和amiRNA,構(gòu)建4個(gè)含有單sRNA的植物表達(dá)載體和4個(gè)含有雙sRNA的植物表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化煙草,進(jìn)行抗病性鑒定,比較研究了多sRNA的組合對(duì)病毒抗性的影響。研究結(jié)果為利用RNA沉默策略高效培育抗病毒轉(zhuǎn)基因植物提供了依據(jù)。主要的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論如下:(1)以PVY~O復(fù)制酶基因NIb的兩個(gè)區(qū)域作為靶序列,按照相關(guān)準(zhǔn)則分別設(shè)計(jì)siRNA 和 amiRNA,構(gòu)建 8 個(gè)植物表達(dá)載體:pR-siR1,pR-siR2,pR-miR1,pR-miR2,pR-siR1siR2,pR-miR1miR2,pR-siR1miR2 和 pR-miR1siR2。(2)以熒光素酶(luciferase,LUC)作為報(bào)告基因與靶基因連接,構(gòu)建融合基因的表達(dá)載體 PVY~N-NIb-LUC 和 PVY~O-NIb-LUC。將 PVY~N-NIb-LUC 和 PVY~O-NIb-LUC 分別與sRNA表達(dá)載體瞬時(shí)共侵染本生煙,結(jié)果顯示,sRNA表達(dá)載體對(duì)PVY~O-NIb-LUC的剪切效率均高達(dá)90%以上,尤其是同時(shí)表達(dá)siRNA和amiRNA的表達(dá)載體,剪切效率最高可達(dá)94.3%;sRNA表達(dá)載體對(duì)PVY~N-NIb-LUC的剪切效率為29%-41.5%,但共表達(dá)siRNA和amiRNA仍具有相對(duì)較高的剪切效率。(3)將構(gòu)建的8種sRNA表達(dá)載體,利用凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404,葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草NC89,獲得轉(zhuǎn)基因植株,利用卡那霉素抗性篩選和PCR檢測(cè),獲得各轉(zhuǎn)基因的植株150株以上。(4)轉(zhuǎn)基因植株的Northern blot分析和熒光定量PCR檢測(cè)表明,各轉(zhuǎn)基因株系中均有sRNA積累,但是積累量存在差異:含雙sRNA的轉(zhuǎn)基因株系pR-miR1miR2、pR-miR1siR2、pR-siR1siR2、pR-siR1miR2,sRNA表達(dá)量累加后高于含單sRNA的轉(zhuǎn)基因株系 pR-miR1、pR-miR2、pR-siR1、pR-siR2,其中 pR-siR1miR2、pR-miR1siR2 株系的sRNA積累量最高。(5)用含有PVY~N和PVY~O的病毒汁液接種轉(zhuǎn)基因煙草各株系,進(jìn)行抗病性分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,pR-miR1miR2、pR-miR1siR2、pR-siR1siR2、pR-siR1miR2、pR-miR1、pR-miR2、pR-siR1、pR-siR2對(duì)PVY~N的抗病率分別為 29.33%、34.54%、24.54%、46.95%、18.80%、21.35%、4.04%、8.57%;對(duì) PVY~O 的抗病率分別為52.34%、59.88%、47.25%、69.04%、43.20%、47.12%、42.82%、44.48%。上述結(jié)果表明,8種sRNA表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株均對(duì)PVY~O表現(xiàn)出較高的抗性,尤其是共表達(dá)siRNA和amiRNA的轉(zhuǎn)基因植株,抗病率最高可達(dá)近70%;推測(cè)是由于堿基錯(cuò)配造成轉(zhuǎn)基因植株對(duì)PVY~N的抗性相對(duì)較低,但共表達(dá)siRNA和amiRNA的轉(zhuǎn)基因植株仍可介導(dǎo)相對(duì)較高的抗性水平,表明這樣的組合方式能有效減少錯(cuò)配造成的病毒逃逸。(6)抗病和感病轉(zhuǎn)基因植株Northern blot分析結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因在RNA水平上得以表達(dá),并且抗病植株中mRNA的積累量明顯低于同類(lèi)型的感病植株;抗病轉(zhuǎn)基因植株中sRNA的積累高于感病植株;表明病毒抗性是由RNA介導(dǎo)的,抗性與sRNA積累量成正相關(guān)。(7)轉(zhuǎn)基因植株Southern blot分析結(jié)果顯示,外源基因已經(jīng)成功整合到煙草的基因組中,部分轉(zhuǎn)pR-siR1miR2、pR-miR1siR2的高抗病毒植株中,存在1-2個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)基因。(8)對(duì)T1代進(jìn)行抗病性分析發(fā)現(xiàn),高抗型轉(zhuǎn)基因植株的后代仍保持對(duì)病毒的高度抗性,表明siRNA和amiRNA介導(dǎo)的抗性穩(wěn)定遺傳到T1代。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S432.41

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1721318