本文選題：IGF1　切入點：TIMP1　出處：《內(nèi)蒙古大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：毛乳頭細(xì)胞是毛囊的一種真皮源細(xì)胞,位于毛囊基底部,對毛囊的發(fā)育和再生起著決定性的作用。絨山羊皮膚中存在初級和次級兩種毛囊,它們對應(yīng)的毛乳頭細(xì)胞分別稱為初級毛乳頭細(xì)胞和次級毛乳頭細(xì)胞。初級和次級毛乳頭細(xì)胞對毛發(fā)的生長有著不同的作用,初級毛乳頭細(xì)胞控制羊毛的生長,次級毛乳頭細(xì)胞控制羊絨的生長。毛發(fā)生長和毛囊發(fā)育是一個的復(fù)雜的調(diào)控過程,它是多條信號通路共同作用的結(jié)果。在之前的研究中發(fā)現(xiàn),毛囊細(xì)胞中的PI3K/AKT和ERK1/2信號通路被激活,能加速毛囊從休止期向生長期轉(zhuǎn)變,延長毛囊的生長期,促進毛囊發(fā)育和毛發(fā)生長。IGF1和TIMP1能夠直接和間接的對AKT、ERK1/2信號通路進行調(diào)節(jié)。本研究選取IGF1和TIMP1基因作為研究對象,探討兩種基因在初級和次級毛乳頭細(xì)胞中對AKT和ERK1/2信號通路的調(diào)節(jié)作用,為進一步研究絨山羊初級和次級毛乳頭細(xì)胞對毛囊發(fā)育和毛發(fā)再生的作用提供實驗依據(jù)。1.毛乳頭細(xì)胞中IGF1、TIMP1、AKT和ERK1/2信號通路及相關(guān)基因的表達情況本研究以初級和次級毛乳頭細(xì)胞為原料,觀察初級和次級毛乳頭細(xì)胞的生長狀態(tài)。通過Realtime-PCR技術(shù)檢測IGF1、TIMP1及AKT和ERK1/2信號通路相關(guān)基因的mRNA水平。結(jié)果顯示,初級毛乳頭細(xì)胞中IGF1、TIMP1、MMP9和PTEN基因的mRNA表達水平較次級毛乳頭細(xì)胞中高,分別為18、2.1、9、1.9倍,初級毛乳頭細(xì)胞中VEGF和KDR基因的mRNA表達水平較次級毛乳頭細(xì)胞中低,分別為0.71、0.08倍;通過Western Blot技術(shù)檢測初級和次級毛乳頭細(xì)胞中IGF1、TIMP1、AKT和ERK1/2的蛋白表達量和AKT、ERK1/2的磷酸化水平。結(jié)果顯示,初級毛乳頭細(xì)胞中IGF1和TIMP1的蛋白表達量較次級毛乳頭細(xì)胞中高,分別為2、1.9倍,初級毛乳頭細(xì)胞中AKT和ERK1/2的蛋白表達量與次級毛乳頭細(xì)胞比沒有顯著差異,分別為1.02、1.01倍。初級毛乳頭細(xì)胞中ERK1/2的蛋白磷酸化水平是次級毛乳頭細(xì)胞的0.4倍,初級毛乳頭細(xì)胞中AKT的蛋白磷酸化水平是次級毛乳頭細(xì)胞的4.6倍。2.載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)染分析通過PCR技術(shù)克隆IGF1和TIMP1基因的CDS序列,以pIRES2-EGFP為骨架載體,構(gòu)建了 PIRES2-EGFP-IGF1和pIRES2-EGFP-TIMP1過表達載體,構(gòu)建了 IGF1-14、IGF1-428、TIMP1-126、TIMP1-173 和 TIMP1-510 五個干擾載體。將過表達和干擾載體通過電轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染到絨山羊初級毛乳頭細(xì)胞中,運用Real time-PCR技術(shù)檢測IGF1和TIMP1過表達和干擾效率。結(jié)果顯示,與對照組相比,IGF1和TIMP1的過表達效率分別為4.8和2倍,IGF1-14和TIMP1-173載體的干擾效果最好,干擾效率分別為0.54、0.39倍。3.IGF1和TIMP1對AKT和ERK1/2信號通路及相關(guān)基因的表達情況將過表達載體 pIRES2-EGFP-IGF1、pIRES2-EGFP-TIMP1 和干擾載體IGF1-14、TIMP1-173分別轉(zhuǎn)染到初級和次級毛乳頭細(xì)胞中,48小時后收集細(xì)胞樣品,提取RNA和蛋白質(zhì),通過實時定量PCR技術(shù)檢測IGF1、TIMP1及AKT和ERK1/2信號通路相關(guān)基因的mRNA水平,蛋白免疫印跡技術(shù)檢測IGF1、TIMP1、AKT和ERK1/2的表達水平及AKT和ERK1/2的蛋白磷酸化水平,結(jié)果顯示:3.1毛乳頭細(xì)胞中IGF1及相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達水平:在IGF1過表達的初級毛乳頭細(xì)胞中,AKT和ERK1/2的轉(zhuǎn)錄水平升高,分別是對照組細(xì)胞的1.35、1.47倍。VEGF的轉(zhuǎn)錄水平降低,是對照組細(xì)胞的0.43倍。IGF1干擾的初級毛乳頭細(xì)胞中,AKT和ERK1/2的轉(zhuǎn)錄水平降低,分別是對照組細(xì)胞的0.60、0.71倍。VEGF的轉(zhuǎn)錄水平降低,是對照組細(xì)胞的0.56倍。IGF1過表達的次級毛乳頭細(xì)胞中,AKT和ERK1/2的轉(zhuǎn)錄水平降低,分別是對照組細(xì)胞的0.73、0.67倍。VEGF的轉(zhuǎn)錄水平是對照組細(xì)胞的0.40倍。IGF1干擾的次級毛乳頭細(xì)胞中,AKT和ERK1/2的轉(zhuǎn)錄水平升高,分別是對照組細(xì)胞的1.45、1.51倍。VEGF的轉(zhuǎn)錄水平是對照組細(xì)胞的0.84倍。結(jié)果表明,在初級毛乳頭細(xì)胞中,IGF1促進AKT和ERK1/2的轉(zhuǎn)錄,然而在次級毛乳頭細(xì)胞中,IGF1抑制AKT和ERK1/2的轉(zhuǎn)錄。在初級和次級毛乳頭細(xì)胞中,IGF1的過表達和干擾都抑制了 VEGF的轉(zhuǎn)錄。3.2毛乳頭細(xì)胞中IGF1及相關(guān)基因的蛋白磷酸化水平:與對照組細(xì)胞相比,在IGF1過表達的初級毛乳頭細(xì)胞中,AKT和ERK1/2的蛋白磷酸化水平分別為1.72、1.61倍,而IGF1-干擾組分別是2.10、1.52倍。在次級毛乳頭細(xì)胞中,與對照組細(xì)胞相比,IGF1過表達組AKT和ERK1/2的蛋白磷酸化水平分別為4.23、0.62倍,而IGF1干擾組分別是5.68、0.78倍。結(jié)果表明,IGF1的過表達和干擾都能夠上調(diào)初級和次級毛乳頭細(xì)胞中AKT的磷酸化水平。在初級毛乳頭細(xì)胞中IGF1的過表達和干擾都提高了 ERK1/2的磷酸化水平,而在次級毛乳頭細(xì)胞中IGF1的過表達和干擾都抑制了 ERK1/2的磷酸化作用。3.3 毛乳頭細(xì)胞中TIMP1及相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達水平:在TIMP1過表達的初級毛乳頭細(xì)胞中,VEGF、KDR、MMP9和PTEN的轉(zhuǎn)錄水平降低,分別是對照組細(xì)胞的0.73、0.65、0.58、0.45倍。TIMP1干擾的初級毛乳頭細(xì)胞中,VEGF、KDR、MMP9和PTEN的轉(zhuǎn)錄水平升高,分別是對照組細(xì)胞的1.26、1.54、1.09、1.05倍。TIMP1過表達的次級毛乳頭細(xì)胞中,VEGF、MMP9、KDR和PTEN的轉(zhuǎn)錄水平降低,分別是對照組細(xì)胞的0.33、0.21、0.28、0.47倍。TIMP1干擾的次級毛乳頭細(xì)胞中,VEGF、KDR、MMP9和PTEN的轉(zhuǎn)錄水平升高,分別是對照組細(xì)胞的1.05、1.35、1.38、1.95倍。結(jié)果表明,在毛乳頭細(xì)胞(初級和次級)中,TIMP1抑制MMP9、VEGF、KDR和PTEN的轉(zhuǎn)錄。3.4毛乳頭細(xì)胞中TIMP1及相關(guān)基因的蛋白磷酸化水平:在TIMP1過表達的初級毛乳頭細(xì)胞中,AKT和ERK1/2的蛋白磷酸化水平分別是對照組細(xì)胞的0.6、2.1倍,TIMP1干擾的初級毛乳頭細(xì)胞中,AKT和ERK1/2的蛋白磷酸化水平分別是對照組細(xì)胞的1.5、6.4倍。TIMP1過表達的次級毛乳頭細(xì)胞中,AKT和ERK1/2的蛋白磷酸化水平分別是對照組細(xì)胞的0.7、0.63倍,TIMP1干擾的次級毛乳頭細(xì)胞中,AKT和ERK1/2的蛋白磷酸化水平分別是對照組細(xì)胞的1.4、0.8倍。結(jié)果表明,在初級和次級毛乳頭細(xì)胞中,TIMP1抑制AKT的蛋白磷酸化水平,在初級毛乳頭細(xì)胞中,TIMP1的過表達和干擾都促進了 ERK1/2的磷酸化水平,在次級毛乳頭細(xì)胞中,TIMP1的過表達和干擾都抑制了 ERK1/2的磷酸化水平。上述結(jié)果表明:在初級毛乳頭細(xì)胞中,IGF1和TIMP1的過表達和干擾會激活ERK1/2信號通路;在次級毛乳頭細(xì)胞中,IGF1和TIMP1的過表達和干擾都抑制ERK1/2信號通路。在初級和次級毛乳頭細(xì)胞中,IGF1表達量的升高和降低都可以上調(diào)激活A(yù)KT信號通路,而TIMP1則對AKT信號通路主要起到負(fù)調(diào)控作用。
[Abstract]:The expression of IGF - 1 , TIMP1 , MMP - 9 and IL - 2 in primary and secondary hair papilla cells was investigated . The results showed that the expression of IGF - 1 , TIMP1 , MMP - 9 and ERK in primary and secondary hair papilla cells was significantly lower than that in secondary - hair papilla cells . The expression levels of IGF1 , TIMP1 , ERK and ERK 1 / 2 were detected by real - time quantitative PCR . The levels of protein phosphorylation of IGF1 , TIMP - 1 , 1 / 2 in the primary and secondary dermal papilla cells were significantly higher than those in the control group .

【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S827

【參考文獻】

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本文編號：1706757