本文選題：分枝桿菌　切入點(diǎn)：透明質(zhì)酸酶　出處：《中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院》2015年碩士論文

【摘要】：結(jié)核病是危害人類和動(dòng)物的重大傳染病之一,尤其是近年來隨著多重耐藥分枝桿菌的出現(xiàn)以及與病毒的混合感染,使得對(duì)結(jié)核病的治療變得越來越困難。因此,研究結(jié)核病的致病機(jī)理、研發(fā)新型高效的結(jié)核病疫苗已成為當(dāng)務(wù)之急。結(jié)核分枝桿菌的分泌蛋白是引發(fā)疾病的重要毒素或逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的工具,盡管已經(jīng)證明了結(jié)核分枝桿菌的幾個(gè)分泌蛋白(Ag85b、ESAT-6等)為重要毒力因子,但該病原致病機(jī)理以及免疫逃避的分子機(jī)制尚不明確。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn),結(jié)核分枝桿菌rv0394c基因的編碼蛋白R(shí)v0394c(SEC)含有跨膜區(qū),預(yù)測SEC蛋白可能為一種分泌型蛋白,且rv0394c基因僅存在于致病性的分枝桿菌如結(jié)核分枝桿菌、非洲分枝桿菌、牛分枝桿菌中,因而可能與分枝桿菌致病性相關(guān);SEC蛋白具有透明質(zhì)酸酶和硫酸軟骨素酶活性,其作用底物是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分,屬于糖胺聚糖類大分子物質(zhì),且透明質(zhì)酸廣泛存在于多種細(xì)胞表面,推測SEC蛋白可能在分枝桿菌粘附宿主細(xì)胞的過程中發(fā)揮重要作用。為了驗(yàn)證這一推測,我們開展了以下實(shí)驗(yàn)研究。本研究首先利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得了重組SEC蛋白,經(jīng)親和層析純化后免疫小鼠,采用細(xì)胞融合、克隆和篩選等技術(shù),制備了針對(duì)該蛋白的單克隆抗體,作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的檢測工具;通過間接ELISA檢測方法,證明了該蛋白具有與DNA和多糖等大分子物質(zhì)的結(jié)合特性;通過激光共聚焦顯微鏡,直觀地觀察到SEC蛋白粘附人肺泡上皮細(xì)胞(A549)的現(xiàn)象。為進(jìn)一步驗(yàn)證SEC蛋白與細(xì)胞的結(jié)合特性,我們將rv0394c基因克隆至大腸桿菌-分枝桿菌穿梭載體pMV262中,構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMV262-sec,電轉(zhuǎn)化入恥垢分枝桿菌MC2155后獲得了組成型表達(dá)rv0394c基因的重組菌MS/SEC;利用A549為細(xì)胞模型與重組菌MS/SEC進(jìn)行互作,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與親本菌相比,重組菌MS/SEC粘附A549細(xì)胞的能力顯著提高,而這種粘附作用可被SEC蛋白以及抗該蛋白的特異性抗體所阻斷;以小鼠為動(dòng)物模型,將重組菌經(jīng)鼻腔感染小鼠,定期檢測重組菌的定殖情況。結(jié)果表明,與親本株相比,重組菌在小鼠肺部的定殖能力增強(qiáng),且能造成肺部組織一定程度的病理變化,而加入外源透明質(zhì)酸則可以促進(jìn)重組菌的清除。此外,通過Western Blot方法檢測SEC蛋白在分枝桿菌各亞細(xì)胞組分中的分布情況,結(jié)果表明,該蛋白主要存在于胞壁,為一種表面錨定蛋白,這也為證明其在分枝桿菌粘附細(xì)胞過程發(fā)揮作用提供了更充分的證據(jù)。綜上所述,本研究首次制備了抗結(jié)核分枝桿菌SEC蛋白的單克隆抗體,為進(jìn)一步研究結(jié)核分枝桿菌SEC蛋白的結(jié)構(gòu)和功能提供了研究工具。通過細(xì)胞粘附試驗(yàn),鑒定出結(jié)核分枝桿菌具有透明質(zhì)酸酶活性的新粘附因子—SEC蛋白,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其可能參與了分枝桿菌的致病過程。本研究的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步豐富了我們對(duì)分枝桿菌致病機(jī)理的理解,也為深入探索透明質(zhì)酸酶在結(jié)核分枝桿菌致病中的作用奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:The recombinant plasmid pMV262 - sec has been cloned into the shuttle vector pMV262 of E . coli - Mycobacterium tuberculosis . The distribution of SEC protein in each sub - cell component of Mycobacterium tuberculosis was detected by Western Blot . The results show that the protein is mainly present in the cell wall and provides more evidence for the role of Mycobacterium tuberculosis . In conclusion , the research results show that it is possible to participate in the pathogenesis of Mycobacterium tuberculosis . The results of this study further enrich our understanding of the pathogenesis of Mycobacterium tuberculosis and provide a basis for further exploring the role of hyaluronic acid in the pathogenesis of Mycobacterium tuberculosis .

【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.61

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1702203