本文選題：PEDV　切入點(diǎn)：ORF3蛋白　出處：《上海海洋大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的急性接觸性腸道傳染病,主要癥狀為嘔吐、腹瀉和脫水。不同年齡的豬都易感染,哺乳仔豬最為嚴(yán)重,給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。ORF3是目前PEDV基因組發(fā)現(xiàn)的唯一的附屬基因,ORF3編碼ORF3蛋白,ORF3蛋白與病毒毒力有關(guān),因此對PEDV ORF3蛋白開展亞細(xì)胞定位信號的研究,有助于了解該蛋白在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)及其毒力作用機(jī)制。本實驗的研究內(nèi)容和結(jié)論如下:⑴實驗前期,將DR13 ORF3蛋白克隆至真核表達(dá)載體pEGFP-C1中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-PEDV-ORF3,并將它和空載體pEGFP-C1分別轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞。16 h后激光共聚焦顯微鏡(LCM)觀察分析,在p EGFP-PEDV-ORF3轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中,融合蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中,而在pEGFP-C1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中,EGFP分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。這表明附加的ORF3蛋白本身或者附加的ORF3蛋白中存在某個結(jié)構(gòu)使其定位在細(xì)胞質(zhì)上。⑵為了驗證ORF3蛋白中是否存在這種結(jié)構(gòu),我們結(jié)合DR13att ORF3的氨基酸序列和CV777wt ORF3預(yù)測跨膜域(TM1:40-63aa、TM2:75-91aa、TM3:116-139aa、TM4:150-173aa)對ORF3蛋白進(jìn)行了截短分區(qū)。第一部分是包含四個預(yù)測跨膜域的ORF3(1-173aa),第二部分是非預(yù)測跨膜域ORF3(174-225aa),構(gòu)建重組質(zhì)粒后分別轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞。16 h后LCM分析,在p EGFP-PEDV-ORF3(1-173aa)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中,融合蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中,而在pEGFP-PEDV-ORF3(174-225aa)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中,融合蛋白分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。說明ORF3(1-173aa)中存在某種結(jié)構(gòu)使融合蛋白不進(jìn)細(xì)胞核。⑶為找出ORF3(1-173aa)中使融合蛋白不進(jìn)細(xì)胞核表達(dá)的結(jié)構(gòu),我們將ORF3(1-173aa)截短為兩部分,第一部分是ORF3(1-91aa),該部分主要包含TM1和TM2,第二部分是ORF3(92-173aa),該部分包含TM3和TM4,構(gòu)建重組質(zhì)粒并分別轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞。16 h后LCM觀察發(fā)現(xiàn)在p EGFP-PEDV-ORF3(1-91aa)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中,融合蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中,而在pEGFP-PEDV-ORF3(92-173aa)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中,融合蛋白分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中,表明ORF3(1-91aa)是使融合蛋白不進(jìn)細(xì)胞核的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。⑷為進(jìn)一步分析ORF3(1-91aa)中是否存在使融合蛋白不進(jìn)細(xì)胞核的關(guān)鍵結(jié)構(gòu),ORF3(1-91aa)被分為兩部分,第一部分為ORF3(1-39aa),該部分不包含預(yù)測跨膜域,第二部分為ORF3(40-91aa),該部分包含TM1和TM2,構(gòu)建重組質(zhì)粒并分別轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞。16 h后LCM觀察發(fā)現(xiàn)在p EGFP-PEDV-ORF3(1-39aa)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中,融合蛋白分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中,而在pEGFP-PEDV-ORF3(40-91aa)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中,融合蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中。為驗證ORF3(40-91aa)是否是阻止融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞核的關(guān)鍵結(jié)構(gòu),我們將整段ORF3序列中的40-91aa敲除,并將剩下的片段克隆至表達(dá)載體p EGFP-C1中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-PEDV-ORF3(1-39+92-225aa)并轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞。16 h后LCM分析發(fā)現(xiàn)融合蛋白分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。這個結(jié)果表明,ORF3蛋白中除攜帶有第40位-91位肽的片段外,其余剩下的片段都能進(jìn)入細(xì)胞核,所以我們判斷ORF3(40-91aa)是使融合蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)的重要結(jié)構(gòu)域。⑸ORF3(40-91aa)中某一部分可能是阻止融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞核的重要結(jié)構(gòu)域,因此對ORF3(40-91aa)進(jìn)行再次截短。ORF3(40-91aa)被分成三部分,第一部分為ORF3(40-63aa),主要包含TM1;第二部分為ORF3(64-74aa),該部分是位于TM1和TM2之間的非預(yù)測跨膜域;第三部分為ORF3(75-91aa),該部分包含TM2,構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-PEDV-ORF3(40-63aa)、pEGFP-PEDV-ORF3(64-74aa)、pEGFP-PEDV-ORF3(75-91aa)后分別轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞。16 h后LCM觀察結(jié)果,在這三個重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Vero細(xì)胞中,融合蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。表明ORF3(40-91aa)中這三個單獨(dú)的氨基酸區(qū)段ORF3(40-63aa)、ORF3(64-74aa)、ORF3(75-91aa)都不能阻止融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞核。⑹我們證實了TM1,TM2和它們之間的連接多肽都不能阻止融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞核,那么這三個部分中的任意兩部分會不會同時起作用呢?基于此,我們構(gòu)建相應(yīng)的重組質(zhì)粒pEGFP-PEDV-ORF3(40-74aa)、pEGFP-PEDV-ORF3(64-91aa)、pEGFP-PEDV-ORF3(40-63+75-91aa)并分別轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞。LCM觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn),融合蛋白分布在這三個重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。因此,我們推斷ORF3的40-91aa序列是使融合蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)的最小單元。
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【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.651

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1665947