發(fā)布時(shí)間：2018-03-19 15:13

  本文選題：家蠶　切入點(diǎn)：圍食膜因子　出處：《西南大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：昆蟲中腸含有一層具有一定彈性和韌性的非細(xì)胞結(jié)構(gòu)的半透性膜——圍食膜(peritrophin membrane,PM),由中腸上皮細(xì)胞分泌形成,在整個(gè)中腸區(qū)域形成sleeve-like結(jié)構(gòu)。昆蟲圍食膜的結(jié)構(gòu)復(fù)雜,組分多樣,其中蛋白質(zhì)是PM的主要成分。圍食膜因子是圍食膜蛋白中至少含有一個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(chitin binding domain,CBD)且能在強(qiáng)變性劑(尿素、鹽酸胍等)作用下可被移除的外周蛋白。研究報(bào)道圍食膜因子在抵抗外源病原物的入侵過程中發(fā)揮著重要作用。本研究基于家蠶全基因組數(shù)據(jù)庫,利用同源性搜索和結(jié)構(gòu)域搜索共鑒定了11個(gè)圍食膜因子基因,并對(duì)圍食膜因子基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。在信息學(xué)分析和基因時(shí)空表達(dá)分析基礎(chǔ)上選定2個(gè)在中腸特異表達(dá)的圍食膜因子Bm001504和Bm009641基因,研究其在外援病原物感染過程中的功能。分析家蠶幼蟲食下BmNPV后不同時(shí)間點(diǎn)的中腸基因表達(dá),發(fā)現(xiàn)Bm001504和Bm009641基因的表達(dá)呈顯著變化。構(gòu)建兩個(gè)基因的過表達(dá)載體,檢測細(xì)胞水平過表達(dá)基因后對(duì)BmNPV增殖復(fù)制的影響,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Bm001504和Bm009641基因均能抑制BmNPV的增殖復(fù)制。在個(gè)體水平對(duì)Bm001504基因分別敲除和過表達(dá)后,檢測BmNPV對(duì)轉(zhuǎn)基因系家蠶的影響。研究結(jié)果如下:1、家蠶圍食膜因子的基因鑒定及生物信息學(xué)分析本文利用同源性搜索和結(jié)構(gòu)域搜索在家蠶全基因組數(shù)據(jù)庫中共鑒定了40個(gè)同源基因。去除3個(gè)含Glyco_hydro_18保守結(jié)構(gòu)域的幾丁質(zhì)酶、4個(gè)含mucin結(jié)構(gòu)域的腸粘蛋白、3個(gè)含Polysacc_deac_1保守結(jié)構(gòu)域的幾丁質(zhì)去乙酰基酶、13個(gè)含有一個(gè)CBD的類圍食膜因子表皮蛋白CPAP1以及6個(gè)含有3個(gè)CBDs的CPAP3后,最終得到11個(gè)圍食膜因子基因。系統(tǒng)發(fā)生分析發(fā)現(xiàn)圍食膜因子基因中同一基因的不同CBDs多聚為一簇。與赤擬谷盜中圍食膜因子基因中CBD的多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)半胱氨酸殘基之間氨基酸的數(shù)目符合以下模式:CX11-17CX5CX9-14CX12CX6-7C。2、家蠶圍食膜因子的基因表達(dá)利用本實(shí)驗(yàn)室已有芯片表達(dá)數(shù)據(jù)對(duì)家蠶圍食膜因子基因的時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)Bm001504、Bm009641、Bm011851在幼蟲期中腸特異高量表達(dá),且食下感染BmNPV后表達(dá)顯著上調(diào)。RT-PCR結(jié)果與芯片表達(dá)數(shù)據(jù)相似。推測Bm009641和Bm001504基因參與BmNPV感染,選定為研究的靶標(biāo)基因�？寺蓚�(gè)基因全長,其編碼氨基酸有信號(hào)肽且有多個(gè)N-和O-連接糖基化位點(diǎn)。qRT-PCR檢測家蠶幼蟲食下Bm NPV后基因表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)Bm001504基因在感染BmNPV6h、8h、12h、24h、72h后上調(diào)表達(dá),Bm009641基因在感染BmNPV6h、8h、24h上調(diào)表達(dá),顯示兩個(gè)基因可能在BmNPV的入侵中有重要功能。3、家蠶圍食膜因子基因在BmNPV入侵中的功能研究分別構(gòu)建Bm001504和Bm009641基因的真核表達(dá)載體,細(xì)胞水平過表達(dá)Bm001504和Bm009641基因后檢測對(duì)BmNPV增殖復(fù)制的影響,發(fā)現(xiàn)處理組與對(duì)照組相比,BmNPV增殖復(fù)制必需基因ie1、vp39和p10的表達(dá)量均顯著降低,表明Bm001504、Bm009641基因在細(xì)胞水平可抑制病毒的增殖復(fù)制。在個(gè)體水平過表達(dá)和敲除Bm001504基因后,檢測轉(zhuǎn)基因系家蠶感染BmNPV后幼蟲存活率及對(duì)Bm NPV增殖復(fù)制的影響,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Bm001504基因后轉(zhuǎn)基因家蠶幼蟲感染BmNPV后的存活率顯著升高,病毒關(guān)鍵基因ie1、vp39和p10的表達(dá)量顯著降低;敲除Bm001504基因后家蠶幼蟲感染BmNPV后的存活率顯著降低,病毒關(guān)鍵基因ie1、vp39和p10的表達(dá)量顯著升高。研究發(fā)現(xiàn)Bm001504和Bm009641基因在保護(hù)家蠶免受外源病原微生物的感染過程中發(fā)揮了重要抑制作用,其作用機(jī)制有待后續(xù)研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S884.51;S881.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 朱玉蘋;韓民錦;查緒樂;陳瑜;沈以紅;;家蠶金屬羧肽酶基因家族的鑒定與表達(dá)分析[J];蠶業(yè)科學(xué);2016年03期

2 姜姍彤;毛浪勇;劉曉勇;姚勤;陳克平;;昆蟲體內(nèi)的天然屏障——圍食膜[J];生物學(xué)雜志;2012年04期

3 周洪旭;李長友;李國勛;;草坪害蟲華北大黑鰓金龜幼蟲圍食膜蛋白Ho-Peritrophin3基因克隆及序列分析[J];草業(yè)學(xué)報(bào);2010年06期

4 李帥;李淑文;李長友;周洪旭;李國勛;;鞘翅目害蟲-華北大黑鰓金龜圍食膜結(jié)構(gòu)的初步研究[J];華北農(nóng)學(xué)報(bào);2008年04期

5 謝玉英;李緒友;;昆蟲圍食膜的研究概況[J];湖北生態(tài)工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào);2007年02期

6 相靜波,劉惠霞,吳文君;昆蟲圍食膜的研究進(jìn)展[J];昆蟲知識(shí);2004年02期

7 郭慧芳,方繼朝,韓召軍;昆蟲病毒增效劑研究進(jìn)展[J];昆蟲學(xué)報(bào);2003年06期

8 陳浩濤,潘雪義,袁哲明,譚濟(jì)才;重組增效蛋白對(duì)棉鈴蟲的弱化作用[J];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2003年04期

9 朱蓉,彭建新,洪華珠;光增白劑對(duì)甜菜夜蛾圍食膜結(jié)構(gòu)的作用與影響[J];昆蟲學(xué)報(bào);2003年04期

10 張嚴(yán)峻,譚軍,林玉清;棉鈴蟲圍食膜的結(jié)構(gòu)和組成[J];浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2000年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 胡小龍;家蠶BmDuox基因分析及中腸圍食膜蛋白鑒定[D];浙江大學(xué);2013年

2 黃璐琳;病原微生物黑胸?cái)⊙挎邨U菌（Bacillus bombyseptieus）等誘導(dǎo)家蠶（Bombyx mori）全基因組寄主應(yīng)答研究[D];西南大學(xué);2010年

3 周陽;家蠶核型多角體病毒（BmNPV）Bm5的基因分析及利用基因芯片篩選抗BmNPV相關(guān)基因[D];江蘇大學(xué);2010年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 夏丹丹;家蠶腸粘蛋白基因的鑒定及功能分析[D];西南大學(xué);2015年

2 陳艷萍;BmNPV病毒感染后家蠶中腸圍食膜蛋白質(zhì)的變化[D];西南大學(xué);2014年

3 劉博;BmNPV感染對(duì)家蠶幼蟲中腸圍食膜的影響[D];西南大學(xué);2012年

，

本文編號(hào)：1634819