本文選題：黃顙魚(yú)　切入點(diǎn)：TOLL樣受體　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：黃顙魚(yú)(Pelteobagrus fulvidraco)是我國(guó)淡水養(yǎng)殖的優(yōu)良品種,近些年由于大規(guī)模和高密度的養(yǎng)殖,其在養(yǎng)殖過(guò)程中極易受到細(xì)菌性疾病的危害,對(duì)黃顙魚(yú)健康養(yǎng)殖造成了嚴(yán)重的影響。TOLL樣受體作為模式識(shí)別受體家族成員之一,通過(guò)識(shí)別微生物表面的病原相關(guān)分子模式,從而介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)向下游傳遞,最終會(huì)活化轉(zhuǎn)錄因子,促進(jìn)前炎癥因子的釋放,從而發(fā)揮免疫作用。對(duì)黃顙魚(yú)TOLL樣受體基因分子特征以及免疫應(yīng)答反應(yīng)進(jìn)行研究,探討其在先天性免疫中的潛在功能,對(duì)黃顙魚(yú)疾病控制具有重要的意義。為此,本研究以TOLL樣受體轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),克隆黃顙魚(yú)Pf_TLR18、Pf_TLR19及Pf_TLR21基因并進(jìn)行序列分析。采用熒光定量PC R對(duì)Pf_TLR18、Pf_TLR19和Pf_TLR21基因在黃顙魚(yú)各組織以及早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的時(shí)空表達(dá)進(jìn)行研究,檢測(cè)滅活嗜水氣單胞菌感染前后3個(gè)TLR基因在5個(gè)免疫組織中轉(zhuǎn)錄水平的變化,以及脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)和聚胞肌苷酸(Poly(I:C))刺激前后3個(gè)TLR基因在黃顙魚(yú)外周血淋巴細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平的變化。取得的主要研究結(jié)果如下:1.黃顙魚(yú)Pf_TLR18、Pf_TLR19和Pf_TLR21基因cDNA序列的克隆和分析黃顙魚(yú)Pf_TLR18的部分cDNA序列長(zhǎng)2254 bp,包含1956 bp的編碼區(qū),298 bp的3'非翻譯區(qū)(UTR),編碼651個(gè)氨基酸。黃顙魚(yú)Pf_TLR19的部分c DNA序列長(zhǎng)2948 bp,包含2262 bp的編碼區(qū),418 bp的3'UTR,編碼753個(gè)氨基酸。黃顙魚(yú)Pf_TLR21的cDNA序列全長(zhǎng)3492 bp,包含206 bp的5'UTR,2799 bp的編碼區(qū)和487 bp的3’UTR,編碼931個(gè)氨基酸。經(jīng)BLAST比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析,黃顙魚(yú)Pf_TLR18、Pf_TLR19和Pf_TLR21基因的核苷酸和氨基酸序列均與斑點(diǎn)叉尾洶(Ictalurus punctatus)相似性最高,親緣關(guān)系最近。2.黃顙魚(yú)Pf_TLR18、Pf_TLR19和Pf_TLR21 mRNA在成體組織和早期發(fā)育階段的表達(dá)Pf_TLR18、Pf_TLR19和Pf_TLR21 mRNA在黃顙魚(yú)成魚(yú)14個(gè)被檢測(cè)的組織中均有表達(dá),其中脾臟最高,頭腎和血液適中,其余較低。黃顙魚(yú)Pf_TLR18、Pf_TLR19和Pf_TLR21 mRNA在早期發(fā)育階段均有表達(dá)。從受精卵到囊胚晚期處在一個(gè)很高的表達(dá)水平,表達(dá)量明顯高于其它胚胎發(fā)育階段。出膜后,這三個(gè)基因的表達(dá)量明顯呈現(xiàn)出不同程度的上調(diào)趨勢(shì)。3.滅活嗜水氣單胞菌刺激前后黃顙魚(yú)Pf_TLR18、Pf_TLR19和Pf_TLR21mRNA在5個(gè)免疫相關(guān)組織中表達(dá)的變化免疫刺激后,Pf_TLR18、Pf_TLR19和Pf_TLR21 mRNA在脾臟、頭腎、中腎、肝臟和血液中均顯著上調(diào)。黃顙魚(yú)Pf_TLR18最早(12 h)在肝臟中達(dá)到峰值。在頭腎和中腎中,Pf_TLR18 mRNA在刺激后6 h至48 h內(nèi)均處在一個(gè)較高的表達(dá)水平,并分別在48 h和24 h達(dá)到峰值。在脾臟中,Pf_TLR18 mRNA表達(dá)水平在刺激后12 h至120 h顯著上調(diào),72 h后達(dá)到峰值。在頭腎和中腎中,Pf_TLR19在刺激后24 h至48 h明顯上調(diào),48 h后達(dá)到最高。在脾臟和肝臟中,Pf_TLR19 mRNA在刺激后均出現(xiàn)少量的下調(diào),但在72 h之后又迅速上升,168 h后達(dá)到峰值。在脾臟和肝臟中,黃顙魚(yú)Pf_TLR21 mRNA在刺激后72 h之內(nèi)基本保持恒定或少量下調(diào),但其在刺激后120 h迅速上調(diào)并在此時(shí)間點(diǎn)達(dá)到峰值。在頭腎和中腎中,Pf_TLR21 mRNA分別在免疫后24 h和48 h達(dá)到峰值。在血液中,Pf_TLR21 mRNA表達(dá)量變化與Pf_TLR18和Pf_TLR19基因相似,它們均在刺激后72 h呈現(xiàn)出顯著上調(diào)的趨勢(shì)并在168 h達(dá)到峰值。4.LPS、PGN和Poly(I:C)刺激后Pf_TLR18、Pf_TLR19和Pf_TLR21 mRNA在黃顙魚(yú)血液淋巴細(xì)胞中表達(dá)量的變化在經(jīng)過(guò)LPS、PGN和Poly(I:C)刺激后,黃顙魚(yú)Pf_TLR18、Pf_TLR19和Pf_TLR21 mRN A的表達(dá)量均在3 h呈現(xiàn)出顯著的上調(diào)。經(jīng)過(guò)LPS刺激后,三個(gè)基因的表達(dá)量在3 h到12 h都保持在一個(gè)較高的水平,盡管在6 h有小幅的下降;經(jīng)過(guò)PGN刺激后的3 h呈現(xiàn)出最高的表達(dá)水平,之后雖有所下降但依然保持在一個(gè)較高水平,在12 h表現(xiàn)為稍高于對(duì)照組的水平;經(jīng)過(guò)Poly(I:C)刺激后,它們均在3 h到6 h持續(xù)上調(diào),并且在6 h達(dá)到最大值,后又在12 h恢復(fù)到對(duì)照組水平。5.黃顙魚(yú)Pf_TLR18、Pf_TLR19和Pf_TLR21胞外區(qū)原核表達(dá)成功構(gòu)建黃顙魚(yú)Pf_TLR18、Pf_TLR19和Pf_TLR21基因胞外區(qū)序列重組表達(dá)載體,經(jīng)大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出融合蛋白�？扇苄詸z測(cè)發(fā)現(xiàn)pGEX-LRR18、pGEX-LRR19和p GEX-LRR21融合蛋白以形成包涵體的方式存在。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1580467