本文選題：微小隱孢子蟲(chóng)　切入點(diǎn)：HCT-8　出處：《吉林大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：微小隱孢子蟲(chóng)是一種人獸共患寄生性原蟲(chóng),主要侵染宿主腸道上皮細(xì)胞,破壞微絨毛結(jié)構(gòu),造成腸道功能紊亂,引發(fā)腹瀉。微小隱孢子蟲(chóng)主要以水源性傳播為主,人類和動(dòng)物通過(guò)飲用污染有微小隱孢子蟲(chóng)卵囊的水后可引發(fā)感染。免疫功能缺陷或低下的人群極易感染,如老人、兒童以及HIV患者等。其中HIV患者感染后可引起持續(xù)性腹瀉,極易導(dǎo)致脫水、休克,甚至死亡。目前尚無(wú)有效的辦法對(duì)微小隱孢子蟲(chóng)病進(jìn)行防治。究其原因,是對(duì)微小隱孢子蟲(chóng)與宿主細(xì)胞的相互作用關(guān)系不清晰。有研究表明,自噬可以幫助細(xì)胞清除入侵病原,維護(hù)細(xì)胞健康。弓形蟲(chóng)在入侵宿主細(xì)胞后可以引發(fā)細(xì)胞自噬,并且利用細(xì)胞自噬產(chǎn)生的能量進(jìn)行自身的增殖,從而增強(qiáng)弓形蟲(chóng)對(duì)細(xì)胞的持續(xù)性感染。微小隱孢子蟲(chóng)和弓形蟲(chóng)同屬胞內(nèi)寄生性原蟲(chóng),微小隱孢子蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞自噬影響如何,以及微小隱孢子蟲(chóng)感染與細(xì)胞自噬之間有何關(guān)系尚不清楚。本研究旨在研究微小隱孢子蟲(chóng)入侵對(duì)宿主細(xì)胞自噬的影響,并探究細(xì)胞自噬與微小隱孢子蟲(chóng)感染之間的關(guān)系。微小隱孢子蟲(chóng)誘導(dǎo)HCT-8細(xì)胞自噬的檢測(cè)。以HCT-8細(xì)胞作為感染模型,通過(guò)Western blot、間接免疫熒光技術(shù)、EGFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染以及透射電子顯微鏡觀察等如下系列試驗(yàn)探究微小隱孢子蟲(chóng)感染對(duì)HCT-8細(xì)胞自噬的影響:1、Western blot試驗(yàn):提取不同培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blot試驗(yàn),檢測(cè)自噬標(biāo)記蛋白LC3、Beclin-1等的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),微小隱孢子蟲(chóng)子孢子與HCT-8細(xì)胞共培養(yǎng)后,LC3I和LC3II逐漸積累增加,表明細(xì)胞有明顯的自噬現(xiàn)象;Beclin-1在8h時(shí)累積最多,表明8h時(shí)細(xì)胞自噬強(qiáng)度最強(qiáng)。2、間接免疫熒光檢測(cè):微小隱孢子蟲(chóng)子孢子感染HCT-8細(xì)8h后,清洗并固定細(xì)胞,進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn),于激光共聚焦顯微鏡下觀察LC3蛋白的變化。結(jié)果顯示,微小隱孢子蟲(chóng)子孢子與HCT-8細(xì)胞共培養(yǎng)8h后,細(xì)胞內(nèi)LC3蛋白熒光斑點(diǎn)呈點(diǎn)狀或者聚集狀分布,表明細(xì)胞發(fā)生自噬。3、EGFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及檢測(cè):對(duì)HCT-8細(xì)胞進(jìn)行EGFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試驗(yàn)后與微小隱孢子蟲(chóng)子孢子共培養(yǎng),收取不同培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞后進(jìn)行固定、DAPI染色,于激光共聚焦顯微鏡下觀察LC3蛋白的動(dòng)態(tài)變化情況。結(jié)果顯示,隨著微小隱孢子蟲(chóng)子孢子與HCT-8細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),EGFP-LC3斑點(diǎn)數(shù)量逐漸增加,表明細(xì)胞自噬強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。4、透射電子顯微鏡觀察:共培養(yǎng)8h后,收集并清洗細(xì)胞,制作超薄切片,并于透射電子顯微鏡下尋找并觀察微小隱孢子蟲(chóng)子孢子和自噬泡的顯微結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示,微小隱孢子蟲(chóng)子孢子可以侵入HCT-8細(xì)胞內(nèi)形成帶蟲(chóng)空泡,并首次觀察到伴隨有自噬泡的產(chǎn)生,表明微小隱孢子蟲(chóng)子孢子入侵HCT-8細(xì)胞后可引發(fā)細(xì)胞自噬。微小隱孢子蟲(chóng)誘導(dǎo)HCT-8細(xì)胞自噬相關(guān)通路蛋白的檢測(cè)。微小隱孢子蟲(chóng)子孢子與HCT-8細(xì)胞共培養(yǎng)8h,收集并清洗細(xì)胞,提取全蛋白后進(jìn)行Western blot試驗(yàn),檢測(cè)PI3K、AKT、MTOR、AMPK、ULK1等自噬相關(guān)通路蛋白的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組中PI3K、AKT、MTOR均下調(diào),而AMPK、ULK1均無(wú)明顯變化,表明微小隱孢子蟲(chóng)可能通過(guò)PI3K-AKT-MTOR通路引發(fā)HCT-8細(xì)胞自噬。Ra和3-Ma處理細(xì)胞對(duì)微小隱孢子蟲(chóng)感染的影響。使用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(Ra)和自噬抑制劑3-Ma分別預(yù)處理HCT-8細(xì)胞后,進(jìn)行微小隱孢子蟲(chóng)和HCT-8細(xì)胞共培養(yǎng),建立微小隱孢子蟲(chóng)熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線,并使用熒光定量PCR檢測(cè)微小隱孢子蟲(chóng)的感染狀況。結(jié)果表明:自噬誘導(dǎo)劑Ra處理細(xì)胞后,微小隱孢子蟲(chóng)的感染顯著減弱,3-Ma處理細(xì)胞后,微小隱孢子蟲(chóng)的感染顯著增強(qiáng)。綜上所述,微小隱孢子蟲(chóng)可以誘導(dǎo)HCT-8細(xì)胞發(fā)生自噬,其中PI3K-AKT-m TOR通路參與自噬過(guò)程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo);自噬誘導(dǎo)劑Ra處理細(xì)胞對(duì)微小隱孢子蟲(chóng)的感染有一定的抑制作用;3-Ma處理細(xì)胞對(duì)微小隱孢子蟲(chóng)的感染有一定的增強(qiáng)作用。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.723

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1571380