發(fā)布時(shí)間：2018-02-28 03:12

  本文關(guān)鍵詞： 氟苯尼考 三疣梭子蟹 ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 基因克隆 解毒代謝　出處：《大連海洋大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：ABCG(ATP-binding cassette transporter G)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)子的一個(gè)成員,是一類跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,通過水解ATP的能量對胞質(zhì)中的外源化合物、代謝產(chǎn)物、離子、糖、氨基酸、脂類等物質(zhì)進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。本文以我國漁用抗生素的使用情況為依據(jù),以甲殼類重要養(yǎng)殖品種三疣梭子蟹為研究對象,以養(yǎng)殖過程中常用抗生素——氟苯尼考(FLR)為代表,采用ABCG蛋白特異性抑制劑——煙曲霉毒素C(FTC)對比研究了氟苯尼考在三疣梭子蟹重要組織中的分布及消除情況;首次克隆了三疣梭子蟹ABCG蛋白基因,并測定了氟苯尼考的解毒代謝相關(guān)酶及相關(guān)基因的表達(dá),并且初步研究了FLR對三疣梭子蟹免疫和抗氧化系統(tǒng)的影響。得到如下結(jié)果:1.ABCG蛋白對氟苯尼考轉(zhuǎn)運(yùn)活力的測定為檢測三疣梭子蟹ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對氟苯尼考轉(zhuǎn)運(yùn)活力的大小,本實(shí)驗(yàn)通過注射ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白特異性抑制劑——FTC,比較有無抑制劑對三疣梭子蟹組織中氟苯尼考累積及消除的變化。結(jié)果表明,在40 mg/kg氟苯尼考劑量下,藥物在體內(nèi)的累積階段,注射抑制劑FTC組的氟苯尼考在肝胰腺、肌肉、鰓和血淋巴中的累積量均高于無抑制劑組,達(dá)峰時(shí)間晚。藥物消除階段,抑制劑組消除速度比無抑制劑組緩慢一些,在血淋巴、肝胰腺、肌肉和鰓中的藥物消除半衰期(t1/2)分別是0.85、1.25、1.91、1.35 h,而無抑制劑組對應(yīng)的消除半衰期為0.80、1.00、1.72、1.73 h,由此表明三疣梭子蟹ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白促進(jìn)了氟苯尼考的轉(zhuǎn)運(yùn)代謝。從各組織ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活力來看,血淋巴、肝胰腺、肌肉和鰓組織分別在3、3、3、6 h達(dá)到最大值,然后逐漸降低。轉(zhuǎn)運(yùn)活力的大小與各組織中氟苯尼考的累積量相對應(yīng),進(jìn)一步證明了三疣梭子蟹ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對氟苯尼考的轉(zhuǎn)運(yùn)作用。2.氟苯尼考對三疣梭子蟹不同組織中ptABCG基因表達(dá)量的影響為深入研究ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在氟苯尼考代謝過程中的作用,采用RACE技術(shù)克隆獲得三疣梭子蟹ABCG的全長cDNA序列,命名為ptABCG(GenBank登錄號:KY242401)。該基因全長2473 bp,包括1747 bp的開放閱讀框(ORF),25 bp的5’非編碼區(qū)(5’UTR)和701bp的3’非編碼區(qū)(3’UTR)。結(jié)構(gòu)功能域分析顯示,該蛋白具有半轉(zhuǎn)運(yùn)子ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基本結(jié)構(gòu)特征,含有1個(gè)疏水性的跨膜區(qū)(transmembrane domain,TMD)和1個(gè)核苷酸結(jié)合區(qū)(nucleotide binding domain,NBD);存在由內(nèi)向外和由外向內(nèi)的2種跨膜螺旋,因此可判斷獲得的cDNA序列是三疣梭子蟹ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因序列。采用RT-PCR法,從mRNA水平分析氟苯尼考對三疣梭子蟹肝胰腺、肌肉、鰓中ptABCG表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,40mg/kg劑量下,3 h前FTC+FLR組各組織中ptABCG的相對表達(dá)水平受到抑制,顯著低于FLR組(P0.05),隨著抑制劑作用的減弱表達(dá)水平迅速提高,肝胰腺、肌肉、鰓中的表達(dá)量分別于12、6、12 h達(dá)到峰值,且高于FLR組,最終兩組的表達(dá)都趨于對照水平。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果從基因水平表明了三疣梭子蟹ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在氟苯尼考的轉(zhuǎn)運(yùn)代謝中發(fā)揮著一定的作用。3.氟苯尼考對三疣梭子蟹解毒代謝途徑的影響研究為研究氟苯尼考在三疣梭子蟹體內(nèi)的解毒代謝途徑,測定了I相解毒代謝酶(APND)、II相解毒代謝酶(GST)的活性及對應(yīng)基因CYP2、GST和Ⅲ相代謝ABCG基因的相對表達(dá)。結(jié)果表明,氟苯尼考對三疣梭子蟹各相酶活力及基因表達(dá)的影響顯著(P0.05),且呈時(shí)間-劑量效應(yīng),對照組則無明顯變化。氟苯尼考對肝胰腺、血淋巴APND及CYP2 mRNA表達(dá)具有抑制作用,于6 h達(dá)最低值,隨后逐漸恢復(fù)至對照組水平;對肝胰腺GST活性及GST mRNA表達(dá)呈誘導(dǎo)作用,且呈現(xiàn)高劑量組中劑量組低劑量組。對血細(xì)胞中GST mRNA表達(dá)的影響與藥物濃度有關(guān),低、中劑量組誘導(dǎo)GST mRNA表達(dá),而高劑量組的表達(dá)活受到抑制,于6 h時(shí)顯著低于對照組(P0.05)。不同濃度氟苯尼考對三疣梭子蟹肝胰腺、鰓、肌肉ABCG mRNA的表達(dá)均具有誘導(dǎo)作用,呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,并有一定的時(shí)間劑量效應(yīng)。由此推斷,ABCG蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)作用隨著藥物及代謝產(chǎn)物在體內(nèi)的累積而增強(qiáng),并且及時(shí)將其排出體外,以防對生物體造成損傷。4.氟苯尼考對三疣梭子蟹生理健康指標(biāo)的影響為研究氟苯尼考對三疣梭子蟹生理健康的影響,對免疫效應(yīng)和抗氧化防御兩個(gè)方面的主要指標(biāo)進(jìn)行檢測,結(jié)果表明:與對照組相比,氟苯尼考對三疣梭子蟹免疫系統(tǒng)中的抗菌和酚氧化酶活力具有顯著的抑制作用(P0.05),且各劑量組出現(xiàn)一定的時(shí)間和劑量效應(yīng);對溶菌活力的變化則無顯著影響(P0.05)。氟苯尼考對三疣梭子蟹肝胰腺、血淋巴中的總抗氧化能力(T-AOC)、SOD活力、GSH活性均產(chǎn)生顯著影響(P0.05),肝胰腺中T-AOC、SOD、GSH分別于6、6、12 h達(dá)到最低值,血淋巴中于3、3、6 h達(dá)到最低值,之后隨時(shí)間延長,低(20 mg/kg)、中(40 mg/kg)劑量組各抗氧化指標(biāo)逐漸恢復(fù)至對照組水平,而高(80mg/kg)劑量組的活性在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)仍處于抑制狀態(tài)。因此,氟苯尼考對三疣梭子蟹免疫和抗氧化系統(tǒng)影響顯著,用于防治疾病的時(shí)要綜合考慮藥物劑量對其生理健康的影響。
[Abstract]:In this paper , we studied the distribution and elimination of fluorophrinin in Portunus trituberculatus by using ABCG protein - specific inhibitor _ FTC . The results showed that the elimination half - life ( t1 / 2 ) of the ABCG protein in the liver , pancreas , muscle and gill was 0 . 85 , 1 . 25 , 1 . 72 and 1 . 73 h . The results showed that the relative expression level of pABCG was significantly lower than that in the FLR group ( P0.05 ) . The results showed that the expression levels of pABCG were significantly higher in the three hours before and after 3 h . The results showed that the expression of the mRNA in the liver , pancreas , muscle and gill was higher than that of the FLR group . The results showed that the expression of GST mRNA in the liver and pancreas was significantly lower than that in the group of the control group . The results showed that the anti - oxidation ability ( T - AOC ) , superoxide dismutase ( SOD ) and GSH ( GSH ) activity of Portunus trituberculatus ( Portunus trituberculatus ) were significantly inhibited ( P0.05 ) .

【學(xué)位授予單位】：大連海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S948

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1 鄭世竹,劉振華;三疣梭子蟹越冬儲養(yǎng)[J];齊魯漁業(yè);2000年06期

2 林學(xué)欽;三疣梭子蟹和捕蟹“，

本文編號：1545506