本文關(guān)鍵詞： 陸地棉 GhSPO11-3基因 核內(nèi)復(fù)制 病毒誘導(dǎo)的基因沉默 鹽脅迫　出處：《鄭州大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：棉花是世界上重要的纖維和油料作物,鹽脅迫對棉花生長發(fā)育及產(chǎn)量有顯著的影響。相關(guān)報道指出SPO11-3基因與植物的耐鹽性相關(guān)。SPO11-3基因是真核生物拓?fù)洚悩?gòu)酶VI A亞基的同源基因,在高等植物中廣泛存在,參與調(diào)控植物一些重要的生物過程,如植物的生長、發(fā)育,適應(yīng)脅迫等過程。但目前關(guān)于棉花SPO11-3基因的研究鮮有報道。本研究以擬南芥的AtSPO11-3基因的序列在陸地棉數(shù)據(jù)庫中進行BLAST搜索,得到相似性最高的序列,設(shè)計引物,從陸地棉中克隆出該基因,暫命名為GhSPO11-3。為進一步研究該基因的功能,本試驗構(gòu)建了與GFP基因融合的亞細(xì)胞定位載體,通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化到洋蔥表皮以進行瞬時表達。通過病毒介導(dǎo)的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)技術(shù)對棉花進行侵染,得到基因沉默的棉花植株后,通過鹽脅迫處理后幼苗生長期的生理生化實驗。本研究獲得以下主要研究結(jié)果:1.從陸地棉品種“中棉所79”中克隆到目的基因。GhSPO11-3的開放閱讀框ORF含有1254 bp,編碼417個氨基酸。GhSPO11-3基因在進化上相對比較保守,GhSPO11-3蛋白同樣包含N末端TP6A_N結(jié)構(gòu)域和保守的催化結(jié)構(gòu)域Toprim。序列分析顯示GhSPO11-3基因與可可和擬南芥氨基酸序列同源性較高。進化樹分析也顯示出棉花GhSPO11-3蛋白與可可和擬南芥同源蛋白的進化距離很近。2.實時熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)GhSPO11-3基因在各個組織中均有表達,在植物葉片中表達量最高,屬于組成型表達的基因。通過洋蔥表皮的瞬時表達進行亞細(xì)胞定位分析,結(jié)果顯示GhSPO11-3主要定位于細(xì)胞核中。3.將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒pYL-156-GhSPO11-3導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101中,當(dāng)棉花還未長出真葉時侵染棉花子葉,待陽性對照的棉花植株出現(xiàn)花白斑時,提取對照組和基因沉默的植株的RNA,結(jié)果表明,基因沉默的棉花植株目的基因mRNA的表達水平受到抑制。與對照組相比基因沉默的棉花植株在表型上出現(xiàn)生長遲滯的現(xiàn)象。通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞倍性,結(jié)果顯示GhSPO11-3基因沉默的實驗組細(xì)胞的核內(nèi)復(fù)制水平比對照組低,在熒光顯微鏡下觀察到基因沉默的細(xì)胞核比對照組的小。4.對GhSPO11-3基因沉默的植株和TRV:GFP對照組植株進行鹽脅迫處理,基因沉默的植株萎蔫嚴(yán)重而對TRV:GFP對照組植株影響較小。在氯化鈉鹽處理下,對棉花植株的生理指標(biāo)進行測定,結(jié)果顯示GhSPO11-3的沉默導(dǎo)致棉花植株在生理變化中更敏感,在鹽脅迫后基因沉默的棉花植株總?cè)~綠素含量和脯氨酸含量與對照組相比要低,而丙二醛(MDA)含量相對較高。熒光定量PCR檢測耐鹽相關(guān)基因的表達量發(fā)現(xiàn),在鹽脅迫兩周后,NCED3、P5CS、RD29A和DREB1A基因表達水平顯著低于對照植株。這些結(jié)果表明GhSPO11-3基因沉默的植株表現(xiàn)出更敏鹽的現(xiàn)象。本研究獲得了陸地棉的GhSPO11-3基因,分析了該基因的結(jié)構(gòu)、組織表達特點以及該基因在核內(nèi)復(fù)制和鹽脅迫中的作用。研究結(jié)果表明GhSPO11-3基因的沉默導(dǎo)致核內(nèi)復(fù)制水平的降低,進而降低植物對鹽脅迫的耐受性。本研究為GhSPO11-3基因的進一步研究提供了理論指導(dǎo),也為提高棉花對鹽脅迫的耐受性提供了一個有效的遺傳學(xué)的手段。
[Abstract]:In this study , it was found that the gene was cloned from upland cotton . The results showed that Ghout11 - 3 gene was cloned from upland cotton . The results showed that Ghout11 - 3 gene was cloned from upland cotton . The results showed that Ghout11 - 3 gene was cloned from upland cotton . The results showed that the gene silencing resulted in the decrease of the level of endogenous replication and the tolerance of plant to salt stress . The research provided theoretical guidance for the further study of Ghout11 - 3 gene , and provided an effective method to improve the tolerance of cotton to salt stress .

【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S562

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本文編號：1537012