本文關(guān)鍵詞： 亞洲璃眼蜱 防御素 原核表達(dá) 功能分析　出處：《河北師范大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：亞洲璃眼蜱(Hyalomma asiaticum)分布于荒漠和半荒漠地區(qū),生境主要在胡楊林和灌叢,宿主為牛、羊、馬、野豬和雙峰駝,也侵襲人。亞洲璃眼蜱可傳播新疆出血熱、Q熱、環(huán)形泰勒蟲病等多種自然疫源性疾病。防御素是一種抗菌多肽,在機(jī)體先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用,研究蜱源防御素對(duì)探索蜱與病原體之間的關(guān)系、開發(fā)抗蜱藥物和控制蜱傳疾病具有重要意義。本研究以亞洲璃眼蜱為研究對(duì)象,提取總RNA后利用Clontech建庫試劑盒構(gòu)建cDNA文庫,利用PCR技術(shù)進(jìn)行分子克隆,得到五條防御素基因,分別命名為Ha-defensin-1、Ha-defensin-2、Ha-defensin-3、Ha-defensin-4和Ha-defensin-5。開放閱讀框大小分別為219bp、222bp、222bp、207bp、和222bp,編碼氨基酸個(gè)數(shù)為73、74、74、69和74,等電點(diǎn)分別為9.08、9.54、9.89、5.53和9.99。與NCBI發(fā)布的其他蜱源防御素的氨基酸序列相似性范圍為53%~82%。對(duì)Ha-defensin-1和Ha-defensin-2進(jìn)行原核表達(dá)并研究重組蛋白的功能。分別將Ha-defensin-1和Ha-defensin-2連入表達(dá)載體pET-32(a+)轉(zhuǎn)入Transetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中表達(dá),并進(jìn)行表達(dá)條件的摸索和優(yōu)化,表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示目的蛋白大小約25kDa,與預(yù)測(cè)大小一致。利用Real-time PCR技術(shù)對(duì)Ha-defensin-1和Ha-defensin-2的表達(dá)情況進(jìn)行初步分析,結(jié)果顯示Ha-defensin-1和Ha-defensin-2基因的表達(dá)具有時(shí)期、組織和不同菌脅迫時(shí)的特異性。通過抑菌圈實(shí)驗(yàn)、最小抑菌濃度和最低殺菌濃度的測(cè)定,結(jié)果顯示重組蛋白pET-32(a+)-Ha-defensin-1和pET-32(a+)-Ha-defensin-2對(duì)革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌有抑菌活性,但存在差異性。抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示重組蛋白pET-32(a+)-Ha-defensin-1和pET-32(a+)-Ha-defensin-2對(duì)ABTS·+和DPPH·自由基具有一定的清除能力。溶血活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示重組蛋白pET-32(a+)-Ha-defensin-1和pET-32(a+)-Ha-defensin-2在86.8μM和93.8μM濃度下的溶血率分別為5.58%和6.39%。對(duì)亞洲璃眼蜱防御素生物學(xué)功能的研究為揭示蜱類先天免疫機(jī)制和開發(fā)新型生物制劑奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:The results showed that the recombinant protein pET - 32 ( a + ) - Ha - deferent - 1 and pET - 32 ( a + ) - Ha - deferent - 2 had antibacterial activity against Gram - positive bacteria , gram - negative bacteria and fungi .

【學(xué)位授予單位】：河北師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.746

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4 郭鳳t，

本文編號(hào)：1531457