本文關(guān)鍵詞：霍山石斛生物鐘相關(guān)基因克隆及其與培養(yǎng)物糖含量分析　出處：《福建農(nóng)林大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：霍山石斛(Dendrobium huoshanense Tang et Cheng)是多年生蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium Sw.)植物,在中國傳統(tǒng)中藥里被譽(yù)為仙草之首,同時(shí)也具有觀賞價(jià)值。本研究對(duì)霍山石斛原球莖和試管苗的離體培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化;對(duì)不同光周期培養(yǎng)條件下原球莖和試管苗的增殖率、器官發(fā)生和組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)以及多糖含量進(jìn)行了觀察和測(cè)定;以原球莖和試管苗為材料,克隆了生物鐘中央振蕩器核心基因(CIRCADIAN CLOCK-ASSOCIATED 1,CCA1)和與中央振蕩器相關(guān)的抗逆基因MYB1R1,對(duì)CC41基因和MYB1R1基因進(jìn)行不同光周期處理,并研究分析其定量表達(dá)結(jié)果,最終通過綜合研究離體培養(yǎng)條件下不同光周期、不同培養(yǎng)環(huán)境、增殖率、多糖含量及基因表達(dá)的關(guān)系,為揭示霍山石斛多糖代謝機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)生物學(xué)和分子生物學(xué)的理論和依據(jù)。1不同光周期條件下霍山石斛的增殖率霍山石斛原球莖培養(yǎng)于MS+NAA O.1mg/L+KT 0.05mg/L+土豆汁 50 g/L 培養(yǎng)基,試管苗培養(yǎng)于 1/2MS+IBA 0.5mg/L+NAA0.5 mg/L+香蕉汁200g/L培養(yǎng)基,比較了原球莖及試管苗在不同光周期處理下的增殖率。試驗(yàn)結(jié)果表明,不同光周期對(duì)原球莖增殖率有一定影響:在黑暗培養(yǎng)條件下最低;在24h、18h、12h、6h光照的光周期條件下培養(yǎng)50天時(shí)增殖率達(dá)到最高并具有相近的增殖率;其中以18小時(shí)光照在培養(yǎng)50天時(shí)增殖率達(dá)到最高;同時(shí)24小時(shí)光照條件下增殖率在各培養(yǎng)時(shí)間段都表現(xiàn)出最高值并在培養(yǎng)40d時(shí)已經(jīng)接近峰值。不同光周期對(duì)試管苗增殖率影響幅度較原球莖的小;自培養(yǎng)10d后,以12h/12hL/D光照條件下增殖率領(lǐng)先,并保持最高。但總體上原球莖增殖率遠(yuǎn)高于試管苗增殖率。2不同光周期培養(yǎng)條件下多糖含量的測(cè)定霍山石斛原球莖培養(yǎng)于MS+NAA0.1mg/L+KT 0.05mg/L+土豆汁 50 g/L 培養(yǎng)基,試管苗培養(yǎng)于 1/2MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基,比較原球莖及試管苗在不同光周期下的多糖含量。試驗(yàn)結(jié)果表明:6小時(shí)光照和全黑暗條件下多糖積累首先到達(dá)最高值,之后逐漸降低;其中以原球莖在6小時(shí)光照條件下培養(yǎng)10d多糖含量已達(dá)到峰值。24小時(shí)光照處理?xiàng)l件下的原球莖和試管苗多糖含量在培養(yǎng)30d時(shí)同樣達(dá)到高水平,之后逐漸降低;其中以試管苗在24小時(shí)光照處理下培養(yǎng)至30d達(dá)到峰值。培養(yǎng)40d及之后,各光周期條件均表現(xiàn)出多糖含量下降至接種時(shí)的多糖含量,說明在培養(yǎng)基養(yǎng)分接近消耗殆盡時(shí)(40d-50d),無法繼續(xù)進(jìn)行多糖積累,只能維持自身生長發(fā)育。不同光周期對(duì)試管苗的多糖含量較對(duì)原球莖的影響較大,在培養(yǎng)1Od之后,光照的增加與多糖含量呈正相關(guān)。試管苗多糖積累水平均高于同期培養(yǎng)時(shí)間的原球莖,而原球莖的多糖積累早于試管苗的多糖積累。3 CCA1基因和MYB1R1基因的克隆和生物信息學(xué)分析以霍山石斛原球莖和試管苗為材料,結(jié)合同源克隆和RACE技術(shù),首次獲得了霍山石斛CC41基因和MYB1R1基因的cDNA全長:(CC41基因cDNA全長為1652 bp,登錄號(hào)為KX710175;MYB1R1基因cDNA全長1332bp,登錄號(hào)為KX710176。這2條基因的cDNA序列的開放閱讀框分別編碼532和427個(gè)氨基酸。通過對(duì)CCA1基因和MYB1R1基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)CCA1是堿性蛋白,MYB1R1是酸性蛋白,都不具有信號(hào)肽,也都不屬于分泌蛋白;其中CCA1和MYB1R1中均含有myb保守結(jié)構(gòu)域,證明了 CCA1與MYB1R1同屬于MYB轉(zhuǎn)錄因子家族。4 CC41基因和MYB1R1基因定量表達(dá)分析以Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因,對(duì)CC41基因和MYB1R1基因在原球莖和試管苗不同光周期處理下的表達(dá)水平進(jìn)行定量表達(dá)分析。本實(shí)驗(yàn)以接近自然晝夜周期的12小時(shí)光照為參照組,在培養(yǎng)第1d、10d、20d、30d、40d及50d時(shí)對(duì)材料進(jìn)行基因定量表達(dá)分析。結(jié)果顯示:CCA1基因、MYB1R1基因在原球莖中的表達(dá)趨勢(shì)基本相同,在試管苗中的表達(dá)趨勢(shì)也基本相同。CC41基因在原球莖中一般先于MYB1R1基因出現(xiàn)表達(dá)波動(dòng),在試管苗中兩者則基本同步。CC41基因、MYB1R1基因在原球莖的表達(dá)趨勢(shì)和試管苗中的表達(dá)趨勢(shì)都不相同。兩者在原球莖中的表達(dá)量高于試管苗中的表達(dá)量。根據(jù)長時(shí)間尺度基因表達(dá)的數(shù)據(jù)推測(cè):MYB1R1基因具有部分生物鐘的節(jié)律功能,或是與生物鐘中央振蕩器直接作用的基因。原球莖在培養(yǎng)第30d時(shí),每隔6h對(duì)不同光周期處理材料取樣,以12小時(shí)光照為參照組,觀察CC41基因和MYB1R1基因在24h內(nèi)的變化趨勢(shì)。結(jié)果顯示:CC41基因在30d時(shí)已經(jīng)全部偏離12h/12h光周期,出現(xiàn)不等振幅及不同光周期的現(xiàn)象;MYB1R1基因在培養(yǎng)第30d時(shí)與CCA1基因相比更接近原來的12h/12h光周期;MYB1R1基因在本實(shí)驗(yàn)條件下也出現(xiàn)不等振幅及周期變化;MYB1R1基因與CC41基因表達(dá)趨勢(shì)相近。根據(jù)短時(shí)間尺度基因表達(dá)的數(shù)據(jù)推測(cè):MYB1R1基因可能具有部分生物鐘的節(jié)律功能,或是與生物鐘中央振蕩器直接作用的基因。以18SrRNA為參照,在半浸沒及干旱脅迫等條件下處理48小時(shí),結(jié)果顯示MYB1R1基因在半浸沒及干旱處理?xiàng)l件下出現(xiàn)明顯表達(dá)變化,在黑暗條件下也出現(xiàn)高表達(dá),說明MYB1R1基因與光照和干旱脅迫有關(guān),可能參與干旱的信號(hào)傳導(dǎo)。綜上所述,以CC41基因?yàn)閰⒄諛?biāo)志的光周期研究發(fā)現(xiàn),光周期影響霍山石斛的多糖含量,以及增殖率和干物質(zhì)含量;原球莖更適于光周期誘導(dǎo)的多糖含量調(diào)控。CC41基因在原球莖中的上升表達(dá)早于在試管苗中的表達(dá)。CC41基因在出現(xiàn)高上調(diào)表達(dá)后,一般會(huì)導(dǎo)致各生理指標(biāo)的提高。CC41基因、MYB1R1基因在原球莖中表達(dá)的幅度大于在試管苗中的幅度,但CCA1基因和MYB1R1基因表達(dá)趨勢(shì)基本相似。在第30d的24h時(shí)間尺度上研究中發(fā)現(xiàn),CCA41基因和MYB1R1基因在偏離半光照條件下出現(xiàn)時(shí)間偏離和表達(dá)不均衡。MYB1R1基因具有部分生物鐘的節(jié)律功能,并可能參與干旱信號(hào)傳導(dǎo)。本文在蘭科植物里第一次提供了M B1R1基因參與光周期和干旱脅迫的表達(dá)研究數(shù)據(jù)。5同步提取RNA和多糖的技術(shù)以霍山石斛愈傷組織、愈傷組織和原球莖為材料,提取材料中RNA后,收集提取過程中的廢棄物進(jìn)行多糖提取。結(jié)果顯示RNA提取質(zhì)量符合基因表達(dá)研究的需要,而且提取的多糖可以與標(biāo)準(zhǔn)的多糖提取具有穩(wěn)定的對(duì)應(yīng)關(guān)系,使原位并實(shí)時(shí)研究基因表達(dá)和多糖分析成為可能。綜上所述,本研究改進(jìn)了霍山石斛的離體培養(yǎng)條件,揭示了培養(yǎng)條件下霍山石斛培養(yǎng)物多糖含量的變化規(guī)律,克隆了生物鐘相關(guān)基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,在長時(shí)間尺度和短時(shí)間尺度水平上對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行了研究,對(duì)霍山石斛在離體培養(yǎng)條件下以增殖和干物質(zhì)比重為背景進(jìn)行了多糖積累機(jī)制的討論。同時(shí),本研究還創(chuàng)新了多糖和核酸的同步提取技術(shù),為進(jìn)一步高效開展霍山石斛的分子生物學(xué)研究提供了較理想的方法。最終通過綜合研究離體培養(yǎng)條件下不同光周期、不同培養(yǎng)環(huán)境、增殖率、多糖含量及基因表達(dá)的關(guān)系,為揭示霍山石斛多糖代謝機(jī)理提供了實(shí)驗(yàn)生物學(xué)和分子生物學(xué)的理論和依據(jù),為提高霍山石斛研究效率提供了優(yōu)化的技術(shù)方法。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S567.239

【參考文獻(xiàn)】

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