發(fā)布時(shí)間：2018-01-10 08:07

  本文關(guān)鍵詞：剛地弓形蟲(chóng)ME49株含信號(hào)肽DNase的表達(dá)與功能分析　出處：《吉林大學(xué)》2017年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：剛地弓形蟲(chóng)是頂復(fù)門(mén)寄生的原蟲(chóng),能夠感染人和哺乳動(dòng)物的幾乎所有有核細(xì)胞。剛地弓形蟲(chóng)病是一種典型的人獸共患病,在世界上幾乎有1/3人感染這種寄生蟲(chóng)病[1]。人類(lèi)和動(dòng)物主要通過(guò)攝入具有感染性的卵囊,或者被污染的水或食物而感染,正常人群感染后通常呈隱性感染,但是在免疫受損的個(gè)體,例如在器官移植、艾滋病、癌癥患者體內(nèi),潛伏感染的剛地弓形蟲(chóng)經(jīng)過(guò)再次活化能夠?qū)C(jī)體帶來(lái)致命的損傷。目前對(duì)于治療急性感染的剛地弓形蟲(chóng)病的藥物有乙胺嘧啶和磺胺嘧啶,但是這類(lèi)藥物具有很強(qiáng)的毒副作用。信號(hào)肽是協(xié)助新合成的蛋白質(zhì)向分泌通道轉(zhuǎn)移的肽段,大部分存在于N-端,包含5-30個(gè)氨基酸。脫氧核糖核酸酶(Deoxyribonuclease)簡(jiǎn)稱(chēng)DNase,是催化DNA主鏈中磷酸二酯鍵的裂解,從而降解DNA的酶,同時(shí)也是參與DNA的復(fù)制、重組和修復(fù)的重要蛋白質(zhì)。一些DNA酶只切割DNA分子末端的殘基稱(chēng)為脫氧核糖核酸外切酶,例如寡核苷酸酶。而能夠從DNA內(nèi)部切割的酶稱(chēng)為脫氧核糖核酸內(nèi)切酶,例如DNaseⅠ、DNaseⅡ。目前研究發(fā)現(xiàn)利什曼蟲(chóng)和布氏錐蟲(chóng)中的DNase能夠通過(guò)切除受損或錯(cuò)配的堿基,從而對(duì)DNA進(jìn)行修復(fù),但是關(guān)于剛地弓形蟲(chóng)DNA的加工降解機(jī)制研究較少。因此本實(shí)驗(yàn)中,選取了兩個(gè)DNase基因進(jìn)行研究。首先對(duì)兩個(gè)DNase序列基因進(jìn)行分析,選取親水性區(qū)域擴(kuò)增構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒,在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行重組蛋白質(zhì)的表達(dá)純化。純化的His標(biāo)簽重組蛋白質(zhì)免疫家兔制備多克隆抗體,通過(guò)間接免疫熒光和Western-blot方法對(duì)天然蛋白質(zhì)進(jìn)行定位和表達(dá)研究。然后通過(guò)生物信息學(xué)分析選出兩個(gè)DNase的功能區(qū),進(jìn)行GST標(biāo)簽重組蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化。然后在體外進(jìn)行DNA降解實(shí)驗(yàn),并通過(guò)加入二價(jià)金屬離子來(lái)檢測(cè)DNase的離子依賴(lài)性。研究結(jié)果分析顯示制備的兔抗His標(biāo)簽重組蛋白抗體效價(jià)均1∶16000,Western blot方法驗(yàn)證顯示抗體能識(shí)別天然DNase蛋白質(zhì)。間接免疫熒光結(jié)果顯示TGME49-204410、TGME49-216600均定位在細(xì)胞質(zhì),而且靠近細(xì)胞膜。體外DNA降解實(shí)驗(yàn)及離子依賴(lài)性實(shí)驗(yàn)表明TGME49-204410和TGME49-216600均表現(xiàn)出Cu2+依賴(lài)性的脫氧核糖核酸內(nèi)切酶的活性。這將為進(jìn)一步探索DNase在剛地弓形蟲(chóng)體內(nèi)的功能和對(duì)剛地弓形蟲(chóng)病的預(yù)防和治療奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:Toxoplasma gondii is a parasitic protozoan that can infect almost all of the nucleated cells in humans and mammals . Toxoplasma gondii is a typical zoonotic , almost 1 / 3 of the world infected with this parasitic disease . DNA degradation experiments and ion - dependent experiments show that both TGME49 - 204 410 and TGME49 - 216600 can express Cu2 + - dependent DNA . The results show that TGME49 - 204 410 and TGME49 - 216600 can be used for DNA degradation .

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S852.7

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7 潘琴;DNase B基因亞克隆、定點(diǎn)突變及目的蛋白的高效表達(dá)和純化[D];福建師范大學(xué);2008年

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本文編號(hào)：1404479