本文關(guān)鍵詞：剛地弓形蟲ME49株含信號肽DNase的表達(dá)與功能分析　出處：《吉林大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：剛地弓形蟲是頂復(fù)門寄生的原蟲,能夠感染人和哺乳動物的幾乎所有有核細(xì)胞。剛地弓形蟲病是一種典型的人獸共患病,在世界上幾乎有1/3人感染這種寄生蟲病[1]。人類和動物主要通過攝入具有感染性的卵囊,或者被污染的水或食物而感染,正常人群感染后通常呈隱性感染,但是在免疫受損的個(gè)體,例如在器官移植、艾滋病、癌癥患者體內(nèi),潛伏感染的剛地弓形蟲經(jīng)過再次活化能夠?qū)C(jī)體帶來致命的損傷。目前對于治療急性感染的剛地弓形蟲病的藥物有乙胺嘧啶和磺胺嘧啶,但是這類藥物具有很強(qiáng)的毒副作用。信號肽是協(xié)助新合成的蛋白質(zhì)向分泌通道轉(zhuǎn)移的肽段,大部分存在于N-端,包含5-30個(gè)氨基酸。脫氧核糖核酸酶(Deoxyribonuclease)簡稱DNase,是催化DNA主鏈中磷酸二酯鍵的裂解,從而降解DNA的酶,同時(shí)也是參與DNA的復(fù)制、重組和修復(fù)的重要蛋白質(zhì)。一些DNA酶只切割DNA分子末端的殘基稱為脫氧核糖核酸外切酶,例如寡核苷酸酶。而能夠從DNA內(nèi)部切割的酶稱為脫氧核糖核酸內(nèi)切酶,例如DNaseⅠ、DNaseⅡ。目前研究發(fā)現(xiàn)利什曼蟲和布氏錐蟲中的DNase能夠通過切除受損或錯配的堿基,從而對DNA進(jìn)行修復(fù),但是關(guān)于剛地弓形蟲DNA的加工降解機(jī)制研究較少。因此本實(shí)驗(yàn)中,選取了兩個(gè)DNase基因進(jìn)行研究。首先對兩個(gè)DNase序列基因進(jìn)行分析,選取親水性區(qū)域擴(kuò)增構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒,在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行重組蛋白質(zhì)的表達(dá)純化。純化的His標(biāo)簽重組蛋白質(zhì)免疫家兔制備多克隆抗體,通過間接免疫熒光和Western-blot方法對天然蛋白質(zhì)進(jìn)行定位和表達(dá)研究。然后通過生物信息學(xué)分析選出兩個(gè)DNase的功能區(qū),進(jìn)行GST標(biāo)簽重組蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化。然后在體外進(jìn)行DNA降解實(shí)驗(yàn),并通過加入二價(jià)金屬離子來檢測DNase的離子依賴性。研究結(jié)果分析顯示制備的兔抗His標(biāo)簽重組蛋白抗體效價(jià)均1∶16000,Western blot方法驗(yàn)證顯示抗體能識別天然DNase蛋白質(zhì)。間接免疫熒光結(jié)果顯示TGME49-204410、TGME49-216600均定位在細(xì)胞質(zhì),而且靠近細(xì)胞膜。體外DNA降解實(shí)驗(yàn)及離子依賴性實(shí)驗(yàn)表明TGME49-204410和TGME49-216600均表現(xiàn)出Cu2+依賴性的脫氧核糖核酸內(nèi)切酶的活性。這將為進(jìn)一步探索DNase在剛地弓形蟲體內(nèi)的功能和對剛地弓形蟲病的預(yù)防和治療奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:Toxoplasma gondii is a parasitic protozoan that can infect almost all of the nucleated cells in humans and mammals . Toxoplasma gondii is a typical zoonotic , almost 1 / 3 of the world infected with this parasitic disease . DNA degradation experiments and ion - dependent experiments show that both TGME49 - 204 410 and TGME49 - 216600 can express Cu2 + - dependent DNA . The results show that TGME49 - 204 410 and TGME49 - 216600 can be used for DNA degradation .

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.7

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本文編號：1404479