本文關(guān)鍵詞：刺參5-HT4R活性特征及生理功能初探　出處：《浙江海洋大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：刺參又稱作仿刺參(Apostichopus japonicus),屬于海參綱(Holothuroidea)刺參科(Stichopodidae),是我國重要的海洋經(jīng)濟(jì)物種。自上世紀(jì)80年代起,人工養(yǎng)殖就已經(jīng)取得突破。但在養(yǎng)殖過程中,夏眠導(dǎo)致刺參體重下降的問題嚴(yán)重影響其養(yǎng)殖產(chǎn)量,揭示刺參夏眠調(diào)控過程及其機(jī)制是解決這一問題的關(guān)鍵。血清素是重要的單胺類神經(jīng)激素,血清素受體(serotonin receptor,5-HTR)是典型的G蛋白偶聯(lián)受體,在動物的攝食調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。本文開展刺參血清素受體Aj5-HTR基因克隆和序列特征分析、亞細(xì)胞定位和受體類型鑒定、在夏眠周期中變動規(guī)律及在代謝調(diào)控中的功能等方面的研究,初步探討了Aj5-HTR在刺參攝食代謝中的調(diào)控作用和機(jī)制。主要取得的研究結(jié)果如下:采用RACE克隆技術(shù)獲得了Aj5-HT4R的全長序列,并對其基因序列特征進(jìn)行了分析,結(jié)果表明,Aj5-HT4R cDNA序列(KX583229)全長1,544 bp,包含233 bp的5'UTR,1,011 bp的ORF和300 bp的3'UTR,可編碼336個(gè)氨基酸。和其他G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)構(gòu)一樣,Aj5-HTR具有典型的七次跨膜結(jié)構(gòu)。并利用系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),血清素受體明顯分為六支:5-HTR1亞型,5-HTR2亞型,5-HTR4亞型,5-HTR5亞型,5-HTR6亞型,及5-HTR7亞型受體。Aj5-HT4R和5-HTR4聚為一支,與棘皮類動物紫海膽5-HTR4-like相似性為40%。通過熒光定量PCR基因表達(dá)定量檢測分析了Aj5-HT4R在不同夏眠時(shí)期刺參組織中的表達(dá)特征。結(jié)果表明,Aj5-HT4R基因在刺參不同組織器官中廣泛表達(dá)。刺參夏眠期間Aj5-HT4R在消化道、肌肉及呼吸樹等組織中基因表達(dá)量呈現(xiàn)不同程度的下降,其中呼吸樹中下降極顯著。利用刺參活體生理實(shí)驗(yàn),初步檢測了5-HT作用下刺參呼吸樹、消化道、肌肉中糖代謝相關(guān)的磷酸果糖激酶AjPFK的表達(dá)量。結(jié)果顯示,相對于對照組(注射磷酸緩沖液),5-HT注射組在肌肉組織中的AjPFK表達(dá)量有顯著升高(P0.05)。結(jié)合上述研究結(jié)果,說明5-HT及其受體5-HTR與刺參夏眠代謝調(diào)控存在關(guān)系。利用細(xì)胞生物學(xué)研究方法,對Aj5-HT4R受體性質(zhì)及亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析。利用構(gòu)建好的Aj5-HT4R-EGFP表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中,用熒光染料DiI染膜、DAPI染核,在激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Aj5-HT4R主要定位在細(xì)胞膜上,與Aj5-HT4R序列中存在七次跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果相一致,表明Aj5-HT4R是一個(gè)膜受體,為下一步研究驗(yàn)證其功能奠定了基礎(chǔ)。另一方面,通過一定濃度梯度的5-HT刺激轉(zhuǎn)染有Aj5-HT4R-EGFP表達(dá)載體的HEK293細(xì)胞,結(jié)果顯示Aj5-HTR在一定濃度(0、100pM、10nM、1μM)配體刺激下出現(xiàn)內(nèi)吞。為深入揭示Aj5-HT4R在刺參夏眠調(diào)控中的功能及其作用機(jī)制,我們運(yùn)用細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究平臺,將構(gòu)建的Aj5-HT4R-Flag轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中,檢測5-HT作用下Aj5-HT4R介導(dǎo)的胞內(nèi)cAMP濃度積累特征,初步分析其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)特征。以上結(jié)果顯示,本論文中獲得的刺參受體蛋白為5-HT4R并具有介導(dǎo)胞內(nèi)cAMP信號的活性。本論文的研究結(jié)果對于今后進(jìn)一步闡明刺參夏眠代謝調(diào)控機(jī)制,指導(dǎo)5-HT在棘皮動物等低等動物中的功能及生理調(diào)控作用機(jī)理相關(guān)研究。
[Abstract]:Sea cucumber Apostichopus japonicus (also known as Apostichopus japonicus), which belongs to the Holothuroidea (Holothuroidea) morinaceae (Stichopodidae), is China's economically important marine species. Since the last century since 80s, artificial breeding is a breakthrough has been made. But in the breeding process, resulting in the decrease of body weight of Apostichopus japonicus aestivation affect the aquaculture production seriously, revealing aestivation regulation process and its mechanism is the key to solve this problem. Serotonin is an important monoamine neurohormone, serotonin receptor (serotonin receptor 5-HTR) is a typical G protein coupled receptors, play an important role in the regulation of food intake in animal. Analysis of sea cucumber serotonin receptor Aj5-HTR gene cloning and sequence characteristics in subcellular localization and receptor type identification, change of law and in the regulation of metabolism function in the aspects of aestivation period, preliminary study of Aj5-HTR in sea cucumber The regulation effect and mechanism of feeding metabolism. The major findings are as follows: the full-length sequence of Aj5-HT4R cloned by RACE technology, and the gene sequences were analyzed, the results show that the Aj5-HT4R cDNA sequence (KX583229) was 1544 BP, containing 233 BP 5'UTR, 1011 BP ORF and 300 BP 3'UTR, encoding 336 amino acids. The same structure and other G protein coupled receptors, Aj5-HTR has seven transmembrane structure typical. And the use of phylogenetic analysis found that serotonin receptors were divided into six branches: 5-HTR1 subtype, 5-HTR2 subtype, 5-HTR4 subtype, 5-HTR5 subtype, 5-HTR6 subtype, and 5-HTR7 receptor subtype.Aj5-HT4R and 5-HTR4 were clustered into one clade, and echinoderms animal Anthocidaris 5-HTR4-like similarity to 40%. PCR gene by fluorescent quantitative quantitative analysis the expression characteristics of Aj5-HT4R in different period of sea cucumber aestivation expression. The result showed that the Aj5-HT4R gene is widely expressed in different tissues and organs. During aestivation of sea cucumber Aj5-HT4R gene expression in the digestive tract, respiratory muscle and tree in tissues showed different degrees of decline, which decreased significantly in the respiratory tree. The use of sea cucumber in vivo physiological experiment, preliminary detection of sea cucumber respiratory tree, under the action of 5-HT digestion that expression of sugar metabolism related muscle phosphofructokinase AjPFK. The results showed that, compared with the control group (injection of phosphate buffer), 5-HT injection group in the muscle tissue of AjPFK expression increased significantly (P0.05). Based on the above results, indicating the existence of 5-HT and its receptor 5-HTR and aestivation of metabolic regulation. Using the methods of cell biology, Aj5-HT4R receptor properties and subcellular localization were analyzed. Using the constructed Aj5-HT4R-EGFP expression vector was transfected into HEK293 cells with fluorescent dye. DiI dye film, DAPI staining, observed that Aj5-HT4R mainly localized in the cell membrane under confocal laser scanning microscope, and Aj5-HT4R sequence in the seven transmembrane structure prediction results are consistent, indicating that Aj5-HT4R is a membrane receptor, which laid the foundation for the next research verify its function. On the other hand, by a certain concentration gradient of 5-HT stimulated Aj5-HT4R-EGFP expression vector transfected HEK293 cells. The results showed that Aj5-HTR in certain concentration (0100pM, 10nM, 1 M) endocytosis of ligand stimulation. There is to reveal Aj5-HT4R in aestivation in the regulation of function and mechanism, we use cellular signal transduction research platform, will the construction of Aj5-HT4R-Flag transfected into HEK293 cells, the accumulation characteristics of cAMP concentration detection under 5-HT Aj5-HT4R mediated intracellular signal transduction, a preliminary analysis of its characteristics. The above results obtained in this thesis show that sea cucumber 5-HT4R receptor protein and is mediated by intracellular cAMP signaling activity. The results of this study to further clarify the regulatory mechanism of aestivation of metabolism, function and physiological regulation mechanism in animal Echinodermata animal guidance in low 5-HT.

【學(xué)位授予單位】：浙江海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4

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本文編號：1362068