本文關(guān)鍵詞：融合表達(dá)TM-1基因和gD基因重組腺病毒的構(gòu)建及免疫效果評(píng)價(jià)　出處：《天津農(nóng)學(xué)院》2017年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 雞傳染性喉氣管炎 gD基因 雞慢性呼吸道疾病 TM-1基因 重組腺病毒構(gòu)建 免疫效果評(píng)價(jià)

【摘要】：雞慢性呼吸道疾病(Chronic Respiratory Dsiease,CRD)是由雞毒支原體(Mycoplasma Gallisepticum,MG)感染引起的慢性、接觸性呼吸道疾病。CRD以慢性呼吸道癥狀,機(jī)體免疫力降低,易引起繼發(fā)感染為主要特征,可引起雞群生產(chǎn)性能降低,胴體廢棄,常給國(guó)內(nèi)外養(yǎng)雞業(yè)造成了十分嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。TM-1蛋白是一種溶血素膜蛋白,與MG粘附宿主細(xì)胞相關(guān),是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫的主要抗原之一,保守性高,變異率低。雞傳染性喉氣管炎(Infectious Laryngotracheitis,ILT)是由傳染性喉氣管炎病毒(Infectious Laryngotracheitis Virus,ILTV)引起的雞的一種急性上呼吸道傳染病,該病可導(dǎo)致雞只死亡,產(chǎn)蛋量減少,呈世界性地分布,已成為危害養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病之一。gD糖蛋白是ILTV復(fù)制和誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)的主要保護(hù)性抗原。本試驗(yàn)通過(guò)質(zhì)粒PCR、雙酶切及測(cè)序鑒定后,將含有TM-1和gD基因的pMD-TM-1和pMD-gD進(jìn)行雙酶切,經(jīng)T4酶連接于克隆載體pDC315-EGFP上,PCR、酶切及測(cè)序鑒定后分別獲得穿梭載體pDC315-TM-1、pDC315-gD和pDC315-TM-1-gD;利用LipoFiterTM脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組穿梭載體與腺病毒大骨架pBHGlox(delta)E1,3cre共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,在真核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)同源重組,經(jīng)熒光顯微觀察、RT-PCR和Western blotting檢測(cè),包裝出能表達(dá)TM-1蛋白、gD蛋白和TM-1-gD融合蛋白的重組腺病毒pBH-TM-1、pBH-gD和pBH-TM-1-gD;P4代重組腺病毒感染48 h后,提取HEK293細(xì)胞總RNA,RT-PCR法檢測(cè)TM-1和gD基因的表達(dá),同時(shí)提取細(xì)胞總蛋白,經(jīng)Western blotting檢測(cè)TM-1蛋白、gD蛋白及TM-1-gD融合蛋白的表達(dá)量;使用Vivapure AdenoPACKTM法純化病毒粒子,以TCID50法確定重組腺病毒pBH-EGFP、pBH-TM-1、pBH-gD和pBH-TM-1-gD的滴度分別為109.5TCID50/mL、109.625TCID50/mL、109.25TCID50/mL和1010.125TCID50/m L,符合后續(xù)動(dòng)物試驗(yàn)所需滴度要求;肌肉注射免疫SFP雛雞,間隔7d加強(qiáng)免疫1次,免疫雞只未出現(xiàn)呼吸道癥狀,且免疫雞體重?zé)o明顯降低(p0.05);于免疫后7 d、14 d、21 d、28 d采血,間接ELISA結(jié)果顯示重組腺病毒pBH-TM-1、pBH-g D免疫效果與疫苗組無(wú)顯著差異(p0.05),雙基因pBH-TM-1-gD誘導(dǎo)MG抗體水平則極顯著低于常規(guī)疫苗組(p0.01),但其誘導(dǎo)的ILTV抗體水平與常規(guī)疫苗組無(wú)差異(p0.05);脾臟指數(shù)分析結(jié)果顯示:與對(duì)照組合pBH-EGFP相比較,重組腺病毒pBH-TM-1、pBH-gD、pBH-TM-1-gD和疫苗組均顯著升高(p0.05),但重組腺病毒pBH-TM-1、pBH-gD、pBH-TM-1-gD和疫苗組均無(wú)顯著性。本研究首次將MG的TM-1基因和ILTV的gD基因融合重組,并成功構(gòu)建可用于真核系統(tǒng)表達(dá)的重組腺病毒pBH-TM-1-gD,在與常規(guī)疫苗對(duì)比的基礎(chǔ)上探討其免疫效果,為研制雞毒支原體病和雞傳染性喉氣管炎兩種禽類(lèi)接觸性呼吸道傳染病二聯(lián)基因工程活載體疫苗提供參考,同時(shí)也為新型禽類(lèi)呼吸道疫苗提供理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:The recombinant adenovirus pDC315 - TM - 1 , pDC315 - gD and pDC315 - TM - 1 - gD were obtained by PCR , double digestion and sequencing . The results showed that the recombinant adenovirus pBH - TM - 1 , pBH - gD , pBH - TM - 1 - gD and the vaccine group had no significant difference ( P < 0.05 ) . The results showed that the recombinant adenovirus pBH - TM - 1 , pBH - gD and pBH - TM - 1 - gD had no significant difference ( P < 0.05 ) . The results of the indirect ELISA showed that the recombinant adenovirus pBH - TM - 1 , pBH - gD , pBH - TM - 1 - gD and the vaccine group had no significant difference ( P < 0.05 ) .

【學(xué)位授予單位】：天津農(nóng)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S858.31

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 程小果;王慧;程寧;陳申秒;吳艷濤;;雞傳染性喉氣管炎的流行與防控[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2016年20期

2 蔡冬冬;羅毅;張輝;邢坤;劉瑞英;陳代平;;雞傳染性喉氣管炎的研究進(jìn)展[J];四川畜牧獸醫(yī);2016年04期

3 王廷鴻;;雞毒支原體感染診斷方法與防治[J];中國(guó)動(dòng)物保健;2016年04期

4 李慕瑤;沈青春;劉羿均;楊慧;馬會(huì)籽;戚麟;孫曄;;雞毒支原體培養(yǎng)基的選擇及其效果評(píng)價(jià)[J];當(dāng)代畜牧;2014年27期

5 劉軍軍;丁亮;魏建忠;檀華蓉;孫裴;劉成文;張丹俊;李郁;;F株雞毒支原體疫苗對(duì)肉雞生產(chǎn)性能的影響[J];中國(guó)生物制品學(xué)雜志;2014年01期

6 李瑞霞;;雞傳染性喉氣管炎的鑒別診斷與防治[J];當(dāng)代畜牧;2013年24期

7 楊紅梅;尹鳳琴;劉娣琴;賈志江;;雞毒支原體和大腸桿菌混合感染的診斷與防治[J];中獸醫(yī)學(xué)雜志;2013年02期

8 李鳳銀;韓現(xiàn)友;;雞傳染性喉氣管炎的防治報(bào)告[J];中國(guó)畜禽種業(yè);2011年06期

9 陳麗園;Tahseen Aziz;;肉雞傳染性喉氣管炎[J];國(guó)外畜牧學(xué)(豬與禽);2010年03期

10 錢(qián)鳳芹;;雞傳染性喉氣管炎基因工程疫苗的研究與應(yīng)用[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2006年08期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 楊明凡;表達(dá)雞傳染性喉氣管炎病毒gD基因與雞IL-2基因重組禽痘病毒的構(gòu)建及其免疫效力研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

2 郝永清;雞毒支原體的分離鑒定及基因免疫的研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前5條

1 孫娜娜;表達(dá)雞傳染性喉氣管炎病毒gI和gB基因的重組新城疫病毒的研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

2 孫燕;表達(dá)傳染性喉氣管炎病毒gB、gD基因的重組火雞皰疹病毒疫苗毒株構(gòu)建及其免疫效力試驗(yàn)[D];揚(yáng)州大學(xué);2015年

3 馮秋霖;新城疫病毒載體疫苗免疫雞對(duì)新城疫和雞毒支原體感染具有效免疫保護(hù)[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

4 黃海瓊;表達(dá)雞傳染性喉氣管炎病毒gB基因的重組馬立克病毒疫苗株的構(gòu)建[D];揚(yáng)州大學(xué);2013年

5 王利麗;雞傳染性喉氣管炎病毒gB、gD基因的真核表達(dá)及免疫效力研究[D];新疆農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

，

本文編號(hào)：1357378