本文關(guān)鍵詞：番茄生長(zhǎng)素酰胺水解酶ILR在花柄脫落過(guò)程中作用研究　出處：《沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：生長(zhǎng)素在調(diào)控器官脫落的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。結(jié)合態(tài)生長(zhǎng)素可被生長(zhǎng)素酰胺水解酶(IAA-Leucine Resistant 1-like Hydrolase,ILR)催化,然后釋放出游離態(tài)的生長(zhǎng)素(IAA)。關(guān)于生長(zhǎng)素對(duì)番茄花柄脫落的調(diào)控機(jī)理已有一定的研究基礎(chǔ),但是關(guān)于生長(zhǎng)素酰胺水解酶對(duì)其調(diào)控作用還不清楚。本研究分析了番茄ILR蛋白結(jié)構(gòu)和水解酶活性,結(jié)合態(tài)生長(zhǎng)素以及CHX對(duì)番茄花柄脫落過(guò)程的影響,結(jié)合ILJR基因的時(shí)空表達(dá),并利用VIGS手段抑制ILR表達(dá),研究其對(duì)花柄脫落的影響。主要研究結(jié)果如下:1.利用不同濃度的IAA-Ala,IAA-Ile和IAA-Asp處理番茄花柄外植體,其中IAA-A1a,IAA-Ile可以顯著延緩脫落發(fā)生,IAA-Asp不能調(diào)控脫落,證實(shí)ILR參與了番茄花柄脫落過(guò)程。在不同時(shí)間加入IAA-Ile和不同的時(shí)間移除IAA-Ile培養(yǎng)基,證實(shí)脫落前8小時(shí)處理均可以延緩脫落發(fā)生。進(jìn)一步利用番茄生長(zhǎng)素響應(yīng)標(biāo)記植株DR5并結(jié)合生長(zhǎng)素含量的測(cè)定,檢驗(yàn)IAA-Ile處理后離區(qū)生長(zhǎng)素的動(dòng)態(tài)變化,結(jié)果表明:外源的IAA-Ile可以有效的提高離區(qū)生長(zhǎng)素含量。采用蛋白合成抑制劑CHX處理證實(shí),單一添加足量生長(zhǎng)素螯合物不能起到延緩脫落的作用。2.采用保守序列Blast的策略,通過(guò)已知物種擬南芥,水稻,大白菜的蛋白比對(duì),找到保守序列后搜索NCBI和SOL,獲得了 7個(gè)(ILR1,ILR,ILR 3,IR4,ILR 5,ILR 6,ILR 7即ILR-7)番茄ILR基因。對(duì)七個(gè)ILR進(jìn)行聚類進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)都具有M20活性中心和M20結(jié)合位點(diǎn)。將已知蛋白的序列進(jìn)行聚類分析,發(fā)現(xiàn)ILR有著較大的不同,暗示,家族蛋白可能存在特異的功能。通過(guò)體外誘導(dǎo)蛋白合成并檢測(cè)其活性,證實(shí)所有的ILR蛋白均具有活性。對(duì)純化的蛋白進(jìn)行HPLC分析,發(fā)現(xiàn)ILR 1-7對(duì)IAA-Ala和IAA-Ile都有水解活性,對(duì)IAA-Ala的水解力要高于IAA-Ile。3.利用qRT-PCR技術(shù)分析ILR組織特異性發(fā)現(xiàn),SlILR 1,5,6和7在離區(qū)有較高的表達(dá)水平,暗示這五個(gè)基因也許在離區(qū)發(fā)育和脫落過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。利用生長(zhǎng)素和乙烯相對(duì)應(yīng)加速和延緩脫落過(guò)程,分別用IAA和1-MCP處理番茄外植體,調(diào)查這一過(guò)程中ILR的時(shí)空表達(dá)差異,結(jié)果顯示SlILR 1,5,6表現(xiàn)出脫落特異的表達(dá)模式。4.采用VIGS病毒沉默策略,農(nóng)桿菌菌液侵染番茄葉片。分別進(jìn)行單獨(dú)的SlILR13,5,6,7沉默,并進(jìn)行了雙重以及多重SlILR1+5,SlILR 1+6,SlILR 5+6以及SlILLR 1+5+6沉默。利用qRT-PCR檢測(cè)鑒定陽(yáng)性植株,對(duì)鑒定出的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行花柄脫落率的測(cè)定。測(cè)定結(jié)果顯示,ILR轉(zhuǎn)基因植株的脫落率高于對(duì)照,并且發(fā)現(xiàn)SlILR 1,.5,6以及1+5,1+6,1+5+6的轉(zhuǎn)基因植株花柄脫落率顯著高出對(duì)照。結(jié)果說(shuō)明ILR基因參加并可延緩番茄花柄脫落的過(guò)程,其中SlILR1,5,6是調(diào)控脫落的關(guān)鍵基因。綜上所述,番茄中共得到7個(gè)ILR家族成員,分別是ILR1,ILR2,ILR3,ILR 4,ILR5,ILR6,IR7。對(duì)ILR 1-7聚類分析,發(fā)現(xiàn)他們都具有M20活性中心和M20結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)ILR蛋白序列進(jìn)行聚類分析,發(fā)現(xiàn)ILR之間存在著較大的差異,并且這7個(gè)蛋白都具有活性,暗示家族蛋白可能存在特異的功能。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí),ILR參與了番茄花柄脫落的過(guò)程,并且在番茄花柄脫落過(guò)程中,存在著生長(zhǎng)素螯合物以及生長(zhǎng)素酰胺水解酶不足的情況,最終結(jié)果發(fā)現(xiàn)ILR 1,5,6是調(diào)控脫落的關(guān)鍵基因。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S641.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1353224