本文關(guān)鍵詞：產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素抗體捕獲ELISA檢測方法的建立和初步應(yīng)用　出處：《山東農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：產(chǎn)氣莢膜梭菌(C.perfringens)又名魏氏梭菌,是一種廣泛存在于自然界和動物腸道中的細菌,屬于條件性致病菌�？僧a(chǎn)生多種外毒素和酶類,主要產(chǎn)生α、β、ε和ι四種毒素,其中α毒素是產(chǎn)氣莢膜梭菌最重要的毒素,各種類型的產(chǎn)氣莢膜梭菌均可產(chǎn)生α毒素。目前,對畜禽產(chǎn)氣莢膜梭菌感染抗體檢測方法主要有小鼠中和試驗、卵磷脂酶抑制試驗等,但因其操作過程復(fù)雜、耗時長,不適于大批量臨床樣品的檢測。國外已經(jīng)出現(xiàn)多種檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌疾病的商品檢測試劑盒,但價格昂貴。所以為了彌補國內(nèi)空白急需建立快速、靈敏、特異并能大批量應(yīng)用于檢測該病的方法。本研究采用實驗室保存的分泌抗產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素單克隆抗體的雜交瘤細胞F12,通過擴大培養(yǎng)、接種小鼠、收集腹水、腹水純化等程序得到α毒素單克隆抗體,并對其效價進行了測定。用實驗室保存的產(chǎn)氣莢膜標準菌株NCTC528進行復(fù)蘇、增菌、產(chǎn)毒、提純等程序得到外毒素,并對其濃度進行檢測。選取1.0-1.5 Kg健康未接種過疫苗的家兔5只,利用滅活的α毒素和弗氏完全佐劑按照等體積混合乳化按照設(shè)定免疫程序?qū)彝眠M行免疫制備高免血清。上述經(jīng)純化后的單克隆抗體F12作為包被抗體,提純后的外毒素作為捕獲抗原,高免血清作為捕獲ELISA的陽性對照血清,從而建立了α毒素抗體捕獲ELISA檢測方法。通過對各步反應(yīng)條件的優(yōu)化,最終獲得最佳工作條件為:單抗1:6400稀釋即工作濃度為0.33μg/m L,待檢血清1:160稀釋,抗原1:1000即工作濃度為2μg/m L。用建立好的ELISA方法檢測33份陰性血清,計算其平均值X=0.243與標準差SD=0.015,求得陽性臨界值為0.288,陰性臨界值為0.273,當血清檢測值C"g0.288(C=X+3SD)時判定為陽性,C"f0.273(C=X+2SD)時為陰性,0.288C0.273時為可疑。特異性結(jié)果表明:該方法對大腸桿菌,沙門氏菌、鴨疫里默氏桿菌分別免疫兔子所得血清無特異性交叉反應(yīng)。敏感性實驗表明:本研究制備的兔抗α毒素高免血清,采用本研究建立的捕獲ELIS A方法測得抗體效價1:640,經(jīng)典小鼠中和實驗測得中和抗體效價為1:400,本研究建立的ELISA方法敏感性較高。重復(fù)性實驗得出批內(nèi)變異系數(shù)為1.21%~6.53%,批間變異系數(shù)為1.78%~7.31%,兩者均小于10%,說明同一樣品在同批和不同批試驗中變異程度小,說明該方法具有很好的重復(fù)性。上述結(jié)果說明,已成功建立特異性、敏感性、重復(fù)性好的用于α毒素抗體捕獲ELI SA檢測方法。該方法為免疫效果的測定提供了一種新的途徑,為臨床快速診斷產(chǎn)氣莢膜梭菌疾病奠定了基礎(chǔ),同時在食品安全等方面具備很好的應(yīng)用前景。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.61

【參考文獻】

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