本文關(guān)鍵詞：產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素抗體捕獲ELISA檢測(cè)方法的建立和初步應(yīng)用　出處：《山東農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：產(chǎn)氣莢膜梭菌(C.perfringens)又名魏氏梭菌,是一種廣泛存在于自然界和動(dòng)物腸道中的細(xì)菌,屬于條件性致病菌�？僧a(chǎn)生多種外毒素和酶類,主要產(chǎn)生α、β、ε和ι四種毒素,其中α毒素是產(chǎn)氣莢膜梭菌最重要的毒素,各種類型的產(chǎn)氣莢膜梭菌均可產(chǎn)生α毒素。目前,對(duì)畜禽產(chǎn)氣莢膜梭菌感染抗體檢測(cè)方法主要有小鼠中和試驗(yàn)、卵磷脂酶抑制試驗(yàn)等,但因其操作過(guò)程復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng),不適于大批量臨床樣品的檢測(cè)。國(guó)外已經(jīng)出現(xiàn)多種檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌疾病的商品檢測(cè)試劑盒,但價(jià)格昂貴。所以為了彌補(bǔ)國(guó)內(nèi)空白急需建立快速、靈敏、特異并能大批量應(yīng)用于檢測(cè)該病的方法。本研究采用實(shí)驗(yàn)室保存的分泌抗產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞F12,通過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)、接種小鼠、收集腹水、腹水純化等程序得到α毒素單克隆抗體,并對(duì)其效價(jià)進(jìn)行了測(cè)定。用實(shí)驗(yàn)室保存的產(chǎn)氣莢膜標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC528進(jìn)行復(fù)蘇、增菌、產(chǎn)毒、提純等程序得到外毒素,并對(duì)其濃度進(jìn)行檢測(cè)。選取1.0-1.5 Kg健康未接種過(guò)疫苗的家兔5只,利用滅活的α毒素和弗氏完全佐劑按照等體積混合乳化按照設(shè)定免疫程序?qū)彝眠M(jìn)行免疫制備高免血清。上述經(jīng)純化后的單克隆抗體F12作為包被抗體,提純后的外毒素作為捕獲抗原,高免血清作為捕獲ELISA的陽(yáng)性對(duì)照血清,從而建立了α毒素抗體捕獲ELISA檢測(cè)方法。通過(guò)對(duì)各步反應(yīng)條件的優(yōu)化,最終獲得最佳工作條件為:單抗1:6400稀釋即工作濃度為0.33μg/m L,待檢血清1:160稀釋,抗原1:1000即工作濃度為2μg/m L。用建立好的ELISA方法檢測(cè)33份陰性血清,計(jì)算其平均值X=0.243與標(biāo)準(zhǔn)差SD=0.015,求得陽(yáng)性臨界值為0.288,陰性臨界值為0.273,當(dāng)血清檢測(cè)值C"g0.288(C=X+3SD)時(shí)判定為陽(yáng)性,C"f0.273(C=X+2SD)時(shí)為陰性,0.288C0.273時(shí)為可疑。特異性結(jié)果表明:該方法對(duì)大腸桿菌,沙門(mén)氏菌、鴨疫里默氏桿菌分別免疫兔子所得血清無(wú)特異性交叉反應(yīng)。敏感性實(shí)驗(yàn)表明:本研究制備的兔抗α毒素高免血清,采用本研究建立的捕獲ELIS A方法測(cè)得抗體效價(jià)1:640,經(jīng)典小鼠中和實(shí)驗(yàn)測(cè)得中和抗體效價(jià)為1:400,本研究建立的ELISA方法敏感性較高。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)得出批內(nèi)變異系數(shù)為1.21%~6.53%,批間變異系數(shù)為1.78%~7.31%,兩者均小于10%,說(shuō)明同一樣品在同批和不同批試驗(yàn)中變異程度小,說(shuō)明該方法具有很好的重復(fù)性。上述結(jié)果說(shuō)明,已成功建立特異性、敏感性、重復(fù)性好的用于α毒素抗體捕獲ELI SA檢測(cè)方法。該方法為免疫效果的測(cè)定提供了一種新的途徑,為臨床快速診斷產(chǎn)氣莢膜梭菌疾病奠定了基礎(chǔ),同時(shí)在食品安全等方面具備很好的應(yīng)用前景。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.61

【參考文獻(xiàn)】

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1 李課;劉雪慧;王海榮;柴同杰;;C、D型二價(jià)產(chǎn)氣莢膜梭菌抗毒素血清的制備及保護(hù)效果評(píng)價(jià)[J];中國(guó)獸藥雜志;2016年08期

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7 王紅寧;;仔豬腹瀉成因及綜合防治技術(shù)措施[J];中國(guó)畜牧雜志;2006年06期

8 王海榮,唐德宏,鹿道新,樊麗,柴同杰;畜舍環(huán)境中魏氏梭菌分離及基因型鑒定[J];中國(guó)人獸共患病雜志;2005年11期

9 張紅英,楊霞,盧中華;魏氏梭菌腸毒素研究進(jìn)展[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2004年09期

10 張紅英,盧中華,楊霞,王亞賓,金鉞;我國(guó)魏氏梭菌病的流行特點(diǎn)[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2004年01期

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本文編號(hào)：1352465