本文關(guān)鍵詞：PHEV感染巨噬細(xì)胞對Ⅰ型干擾素抑制作用的研究

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【摘要】：豬血凝性腦脊髓炎(porcine hemagglutinating encephalomyelitis,PHE)是由豬血凝性腦脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)引起豬的一種傳染病。根據(jù)該病的主要特征,可分為兩種類型,一種是以嘔吐癥狀為主的嘔吐消耗型,另一種是以神經(jīng)癥狀為主的腦脊髓炎型。目前,該病在包括我國在內(nèi)的多個(gè)國家均有發(fā)生和流行,給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。動(dòng)物機(jī)體在病毒感染早期,參與先天性免疫的細(xì)胞會(huì)分泌I型干擾素(I-interferon,I-IFN)來抵抗病毒的侵害,但有的病原感染會(huì)通過多種逃避機(jī)制避免I-IFN對其影響。PHEV感染早期,機(jī)體是否會(huì)通過分泌這一細(xì)胞因子來發(fā)揮一定的抗病毒作用,目前還不清楚。I-IFN是參與先天性免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞因子,為了解PHEV感染機(jī)體后I-IFN的分泌情況,本實(shí)驗(yàn)用PHEV感染BALB/c小鼠,待第5 d病毒復(fù)制量達(dá)到最高峰時(shí),提取腦和脊髓總蛋白,通過ELISA方法對IFN-β含量進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示,脊髓中檢測出的量和空白對照組相比無顯著性差異,腦組織中IFN-β分泌量也僅為80 ng/L,說明PHEV雖然可以在腦和脊髓中復(fù)制,卻不具備高誘導(dǎo)IFN-β表達(dá)的能力,這有可能是PHEV引起神經(jīng)癥狀的重要原因,上述研究表明,PHEV體內(nèi)感染,可逃避IFN-β的免疫識(shí)別。PHEV感染機(jī)體后,可突破外周免疫系統(tǒng),本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn),DC識(shí)別PHEV后不能通過分泌I-IFN方式發(fā)揮抗病毒作用。巨噬細(xì)胞作為機(jī)體另一種重要的外周免疫細(xì)胞,其對病毒的處理能力以及產(chǎn)生的先天性免疫反應(yīng)尚不清楚。我們首先對病毒在巨噬細(xì)胞中的復(fù)制情況進(jìn)行檢測,即將PHEV感染腹腔巨噬細(xì)胞、RAW和J774A.1細(xì)胞24 h,免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn),三種細(xì)胞均呈現(xiàn)病毒陽性信號,此結(jié)果表明病毒可以感染并在巨噬細(xì)胞中復(fù)制增殖。巨噬細(xì)胞是I-IFN的主要來源細(xì)胞,為了解PHEV對巨噬細(xì)胞IFN-β誘生作用的影響,通過熒光定量PCR法對RAW和J774A.1細(xì)胞感染PHEV后IFN-βm RNA進(jìn)行檢測,并以IFN-β產(chǎn)生的強(qiáng)烈誘導(dǎo)劑水皰性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)刺激RAW細(xì)胞做陽性對照,結(jié)果顯示,PHEV感染J774A.1細(xì)胞24 h以及VSV感染RAW細(xì)胞9 h即可強(qiáng)烈地誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-β,而RAW細(xì)胞在病毒感染36 h后才檢測到少量的IFN-β,說明PHEV早期誘導(dǎo)這兩種巨噬細(xì)胞系IFN-β產(chǎn)生的能力被抑制。為說明PHEV感染巨噬細(xì)胞對IFN-β蛋白水平的影響,ELISA方法檢測PHEV感染腹腔巨噬細(xì)胞和兩種細(xì)胞系IFN-β含量,結(jié)果顯示PHEV感染24 h,RAW和腹腔巨噬細(xì)胞并未檢測出IFN-β,J774A.1細(xì)胞在感染12 h之前IFN-β也呈基礎(chǔ)水平表達(dá),結(jié)合定量結(jié)果,表明PHEV可以抑制早期巨噬細(xì)胞的IFN-β表達(dá)。IRF-3是調(diào)控I-IFN產(chǎn)生的上游核轉(zhuǎn)錄因子,通常存在于胞質(zhì)中,一旦被激活則由胞質(zhì)移入胞核。為深入研究巨噬細(xì)胞中PHEV對I-IFN的抑制機(jī)制,將PHEV感染RAW和J774A.1細(xì)胞,通過免疫熒光技術(shù)對IRF-3進(jìn)行核定位檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PHEV感染24 h后,IRF-3依然定位于胞質(zhì)。該結(jié)果表明PHEV感染后并未激活巨噬細(xì)胞的IRF-3通路,提示我們PHEV可能通過抑制IRF-3或其上游調(diào)控因子,進(jìn)而抑制IFN-β的產(chǎn)生。為了解PHEV感染巨噬細(xì)胞發(fā)揮作用的模式識(shí)別受體,我們用活病毒和滅活病毒同時(shí)處理J774A.1細(xì)胞,通過熒光定量PCR方法檢測發(fā)現(xiàn),PHEV滅活病毒失去了誘導(dǎo)IFN-β分泌的能力,表明胞質(zhì)模式識(shí)別受體可以參與對PHEV的識(shí)別。常見的胞質(zhì)模式識(shí)別受體有三種,RIG-I、MDA5、LGP2,為了篩選發(fā)揮主要作用的受體,應(yīng)用RNA干擾技術(shù)對RIG-I、MDA5、LGP2進(jìn)行瞬時(shí)沉默。結(jié)果顯示,PHEV感染24 h后,MDA5瞬時(shí)沉默的細(xì)胞中IFN-β蛋白水平顯著降低,提示MDA5參與了PHEV誘導(dǎo)IFN-β的產(chǎn)生過程。此外,Western blot檢測發(fā)現(xiàn),干擾MDA5可以顯著增強(qiáng)PHEV的復(fù)制能力,表現(xiàn)為病毒蛋白表達(dá)水平的顯著升高。以上結(jié)果表明,MDA5是參與PHEV感染的關(guān)鍵胞質(zhì)模式識(shí)別受體,該通路的激活可以發(fā)揮抗PHEV作用。綜上所述,PHEV感染巨噬細(xì)胞后,可被巨噬細(xì)胞內(nèi)模式識(shí)別受體MDA5識(shí)別,并通過抑制IFN-β表達(dá)而逃避機(jī)體的抗病毒天然免疫作用。由此推測,病毒可逃脫外周免疫防御系統(tǒng)進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮致病作用,引起神經(jīng)損傷。該研究成果揭示了PHEV感染巨噬細(xì)胞過程中宿主關(guān)鍵模式識(shí)別受體及其抗病毒天然免疫作用,可為后期深入研究PHEV逃逸宿主先天性免疫識(shí)別機(jī)制提供參考依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.65

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本文編號：1296941