本文關鍵詞：中蜂幼蟲酵母雙雜交文庫構建及其與囊狀幼蟲病毒VP3互作蛋白篩選

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【摘要】：目的通過構建中華蜜蜂幼蟲酵母cDNA文庫,利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與中蜂囊狀幼蟲病毒(Chinese sacbrood bee virus,CSBV)VP3相互作用的宿主蛋白,并對其相互作用進行鑒定,為深入研究CSBV的致病機理奠定基礎。方法提取中華蜜蜂幼蟲總RNA,合成cDNA與p GADT7連接,構建中華蜜蜂幼蟲酵母cDNA文庫,并對文庫的的滴度、插入片段的大小進行檢測。在此基礎上,將CSBV VP3基因克隆至真核表達載體pGBKT7,構建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-VP3,將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-VP3轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細胞中,檢測其自激活能力及對酵母細胞的毒性作用。將含有誘餌質(zhì)粒pGBKT7-VP3的酵母感受態(tài)細胞與中華蜜蜂幼蟲的cDNA文庫進行融合,利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選出陽性克隆,挑取陽性克隆作為PCR的模板,進行PCR擴增,送測序,參照相關的文獻對捕獲蛋白測序結果進行分析,推測與VP3可能的互作蛋白,半乳凝素1(Galectin1),將獲得的Galectin1基因克隆到p GADT7載體上,進行酵母回返實驗。同時,根據(jù)大腸桿菌密碼子偏嗜性分別對Galectin1基因和VP3基因進行密碼子優(yōu)化,構建p GEX6P-1-Galectin1和p ET28-a-vp3重組原核表達質(zhì)粒,進行原核表達純化,利用Far-western blot技術驗證Galectin1與VP3的相互作用。結果本研究提取到了高純度未降解的RNA,能夠達到構建中華蜜蜂幼蟲酵母cDNA文庫的要求,所構建的中華蜜蜂幼蟲酵母cDNA文庫容量為1.25×107 cfu,文庫滴度為2.5×106 cfu/m L,對隨機挑選24個陽性克隆進行PCR擴增,電泳檢測結果顯示插入片段均勻分布,大小在1.5-3 kbp,24個陽性克隆PCR產(chǎn)物電泳泳道中無空白,由此可知文庫的重組率為100%。將構建的誘餌質(zhì)粒pGBKT7-VP3轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細胞,表明誘餌質(zhì)粒pGBKT7-VP3無自激活能力且對酵母細胞無毒性。在此基礎上,從中華蜜蜂幼蟲的cDNA文庫篩選出了與CSBV VP3蛋白相互作用的宿主蛋白:Galectin1,通過對Galectin1基因和VP3基因密碼子優(yōu)化,實現(xiàn)重組蛋白p GEX6P-1-Galectin和p ET-28a-VP3在大腸桿菌中高效表達,并對重組蛋白分別進行純化。通過酵母回返實驗初步驗證和Far-western blot技術證實,Galectin1與VP3存在相互作用。結論1、成功構建了中華蜜蜂幼蟲酵母cDNA文庫。2、成功構建了pGBKT7-VP3誘餌質(zhì)粒,并利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選出了與VP3相互作用的蛋白,Galectin1。3、經(jīng)酵母回返實驗和Far-western blot技術的驗證,Galectin1與VP3確實存在相互作用。
【學位授予單位】：錦州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S895

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本文編號：1275224