本文關(guān)鍵詞：中蜂幼蟲酵母雙雜交文庫構(gòu)建及其與囊狀幼蟲病毒VP3互作蛋白篩選

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【摘要】：目的通過構(gòu)建中華蜜蜂幼蟲酵母cDNA文庫,利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與中蜂囊狀幼蟲病毒(Chinese sacbrood bee virus,CSBV)VP3相互作用的宿主蛋白,并對其相互作用進(jìn)行鑒定,為深入研究CSBV的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。方法提取中華蜜蜂幼蟲總RNA,合成cDNA與p GADT7連接,構(gòu)建中華蜜蜂幼蟲酵母cDNA文庫,并對文庫的的滴度、插入片段的大小進(jìn)行檢測。在此基礎(chǔ)上,將CSBV VP3基因克隆至真核表達(dá)載體pGBKT7,構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-VP3,將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-VP3轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細(xì)胞中,檢測其自激活能力及對酵母細(xì)胞的毒性作用。將含有誘餌質(zhì)粒pGBKT7-VP3的酵母感受態(tài)細(xì)胞與中華蜜蜂幼蟲的cDNA文庫進(jìn)行融合,利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選出陽性克隆,挑取陽性克隆作為PCR的模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,送測序,參照相關(guān)的文獻(xiàn)對捕獲蛋白測序結(jié)果進(jìn)行分析,推測與VP3可能的互作蛋白,半乳凝素1(Galectin1),將獲得的Galectin1基因克隆到p GADT7載體上,進(jìn)行酵母回返實驗。同時,根據(jù)大腸桿菌密碼子偏嗜性分別對Galectin1基因和VP3基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化,構(gòu)建p GEX6P-1-Galectin1和p ET28-a-vp3重組原核表達(dá)質(zhì)粒,進(jìn)行原核表達(dá)純化,利用Far-western blot技術(shù)驗證Galectin1與VP3的相互作用。結(jié)果本研究提取到了高純度未降解的RNA,能夠達(dá)到構(gòu)建中華蜜蜂幼蟲酵母cDNA文庫的要求,所構(gòu)建的中華蜜蜂幼蟲酵母cDNA文庫容量為1.25×107 cfu,文庫滴度為2.5×106 cfu/m L,對隨機(jī)挑選24個陽性克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳檢測結(jié)果顯示插入片段均勻分布,大小在1.5-3 kbp,24個陽性克隆PCR產(chǎn)物電泳泳道中無空白,由此可知文庫的重組率為100%。將構(gòu)建的誘餌質(zhì)粒pGBKT7-VP3轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細(xì)胞,表明誘餌質(zhì)粒pGBKT7-VP3無自激活能力且對酵母細(xì)胞無毒性。在此基礎(chǔ)上,從中華蜜蜂幼蟲的cDNA文庫篩選出了與CSBV VP3蛋白相互作用的宿主蛋白:Galectin1,通過對Galectin1基因和VP3基因密碼子優(yōu)化,實現(xiàn)重組蛋白p GEX6P-1-Galectin和p ET-28a-VP3在大腸桿菌中高效表達(dá),并對重組蛋白分別進(jìn)行純化。通過酵母回返實驗初步驗證和Far-western blot技術(shù)證實,Galectin1與VP3存在相互作用。結(jié)論1、成功構(gòu)建了中華蜜蜂幼蟲酵母cDNA文庫。2、成功構(gòu)建了pGBKT7-VP3誘餌質(zhì)粒,并利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選出了與VP3相互作用的蛋白,Galectin1。3、經(jīng)酵母回返實驗和Far-western blot技術(shù)的驗證,Galectin1與VP3確實存在相互作用。
【學(xué)位授予單位】：錦州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S895

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本文編號：1275224