本文關(guān)鍵詞：細(xì)菌表達(dá)dsRNA和寄主表達(dá)hairpin dsRNA介導(dǎo)的玉米黏蟲(chóng)chitinase基因的RNA干擾研究

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【摘要】：玉米黏蟲(chóng)(Mythimna separata)屬于鱗翅目夜蛾科,是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng),嚴(yán)重暴發(fā)時(shí)會(huì)造成農(nóng)作物大面積減產(chǎn)甚至絕收。RNA干擾(RNA interference,RNAi)是指生物體內(nèi)源或者外源的雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)介導(dǎo)產(chǎn)生特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默的現(xiàn)象。RNAi除了在模式昆蟲(chóng)如果繩(D.melannogaster)中得到廣泛應(yīng)用以外,在非模式昆蟲(chóng)中也得到了成功的應(yīng)用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),RNA干擾技術(shù)與第二代測(cè)序技術(shù)相結(jié)合,可以快速找到非模式昆蟲(chóng)的致死效應(yīng)的靶基因序列,加快了利用RNAi技術(shù)控制害蟲(chóng)的步伐。本研究以玉米黏蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶編碼基因(chitinase)為候選基因,分別設(shè)計(jì)合成了chitinase 和chitinase2基因RNA干擾序列,為了達(dá)到RNA干擾效應(yīng),我們?cè)O(shè)計(jì)了兩個(gè)實(shí)驗(yàn)方案。第一,采用了細(xì)菌表達(dá)dsRNA的RNA干擾系統(tǒng)(即大腸桿菌HT115和L4440載體)對(duì)靶基因進(jìn)行了 RNA干擾。根據(jù)L4440載體的兩端各有一個(gè)T7啟動(dòng)子的特點(diǎn),設(shè)計(jì)并構(gòu)建了針對(duì)玉米黏蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶(chitinase)基因的RNA干擾載體,將構(gòu)建成功的重組載體導(dǎo)入大腸桿菌HT115感受態(tài)細(xì)胞中。在IPTG誘導(dǎo)下,成功獲得了靶標(biāo)基因(chitinael和chitinae2)所對(duì)應(yīng)的dsRNA。誘導(dǎo)產(chǎn)生的dsRNA經(jīng)純化后,混合人工飼料飼喂玉米黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)。持續(xù)飼喂七天后,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定玉米黏蟲(chóng)編碼幾丁質(zhì)酶(chitinase)基因的mRNA表達(dá)量。結(jié)果表明,chitinase1和chitinase2基因的表達(dá)量相比于對(duì)照組均有明顯降低的現(xiàn)象,顯示目的基因的表達(dá)受到了特異性的抑制。同時(shí)發(fā)現(xiàn),對(duì)chitinase1、chitinase2基因的特異的干擾也引起了玉米黏蟲(chóng)的體重減少和死亡率增加的現(xiàn)象。第二,將上述chitinase1和chitinase2基因片段以hairpin dsRNA的形式在植物中表達(dá),深入研究利用RNA干擾技術(shù)培養(yǎng)抗玉米黏蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物。利用Gateway克隆技術(shù)構(gòu)建了含有目的基因的hairpin dsRNA植物雙元表達(dá)載體。將構(gòu)建成功的植物雙元表達(dá)載體導(dǎo)入水稻中,獲得穩(wěn)定表達(dá)靶基因的轉(zhuǎn)基因水稻。結(jié)果表明,入門(mén)載體和植物雙元表達(dá)載體均構(gòu)建成功并且獲得了穩(wěn)定表達(dá)靶基因的轉(zhuǎn)基因水稻。經(jīng)卡納霉素抗生素篩選和PCR鑒定,分別得到了轉(zhuǎn)chi1基因的22株和chi2基因的13株植物。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S433.4

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 張麗萍;;黏蟲(chóng)的生活習(xí)性及防治措施[J];農(nóng)業(yè)技術(shù)與裝備;2013年16期

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本文編號(hào)：1266688