本文關(guān)鍵詞：小鹽芥ThPP1基因增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因水稻的耐堿性

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【摘要】：在鹽堿脅迫條件下,無(wú)機(jī)焦磷酸化酶對(duì)植物體內(nèi)的離子及可溶性小分子的運(yùn)輸具有重要的調(diào)節(jié)功能。本試驗(yàn)將小鹽芥無(wú)機(jī)焦磷酸化酶ThPP1基因轉(zhuǎn)入水稻中,探究堿脅迫下ThPP1基因在轉(zhuǎn)基因水稻中的調(diào)控作用,明確ThPP1基因響應(yīng)抗逆脅迫的分子機(jī)制,為培育抗逆的分子育種提供理論依據(jù)與材料支撐。生物信息學(xué)分析表明,小鹽芥ThPP1基因的開(kāi)放閱讀框?yàn)?00 bp,編碼300個(gè)氨基酸,分子量約為33.5kDa(登錄號(hào):KC250018.1)。ThPP1基因蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu),擁有緊湊的單域結(jié)構(gòu),其保守域序列與擬南芥無(wú)機(jī)焦磷酸化酶保守域序列具有高度同源性。亞細(xì)胞定位試驗(yàn)表明,ThPP1蛋白定位在細(xì)胞溶質(zhì)內(nèi),屬于可溶性的無(wú)機(jī)焦磷酸化酶,這與PPase Ⅰ家族蛋白結(jié)構(gòu)一致。堿脅迫下小鹽芥ThPP1基因表達(dá)模式分析顯示,隨堿脅迫的加劇小鹽芥ThPP1基因表達(dá)量明顯升高,這說(shuō)明小鹽芥ThPP1基因受堿脅迫誘導(dǎo)。為驗(yàn)證ThPP1基因在應(yīng)對(duì)堿脅迫時(shí)的生理功能,將小鹽芥ThPP1基因轉(zhuǎn)入水稻品種kitaake中,獲得轉(zhuǎn)基因水稻株系,并對(duì)堿脅迫條件下轉(zhuǎn)基因及野生水稻的各項(xiàng)生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明:堿脅迫條件下,轉(zhuǎn)基因水稻的生物重、葉片中蔗糖和淀粉含量顯著高于野生型株系,葉綠素含量和光合速率也顯著高于野生型株系;分析水稻的滲透調(diào)節(jié)能力和維持離子平衡能力的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),堿脅迫下,轉(zhuǎn)基因水稻體能累積更多降低植物滲透勢(shì)的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和減少了細(xì)胞膜損傷,保證了水分的正常吸收,維持了植株體內(nèi)的離子平衡;轉(zhuǎn)基因水稻中較低的鈉鉀比減輕了堿脅迫下Na+的毒害。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在堿脅迫下,轉(zhuǎn)基因水稻中ThPP1基因的表達(dá)引起了水稻內(nèi)源基因的差異表達(dá),這些基因的差異表達(dá)主要影響植物細(xì)胞組分氧化還原過(guò)程和代謝過(guò)程,改變了植物的代謝途徑和次生代謝物合成途徑。為研究ThPP1參與植物耐堿性生理調(diào)控的分子機(jī)制,利用分裂泛素酵母雙雜交系統(tǒng)初步篩選到小鹽芥ThPP1的1個(gè)互作蛋白:16#。生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn),16#與LHCB6蛋白同源性較高,可初步斷定16#主要參與小鹽芥的光合作用。因此,ThPP1基因可能以互作的方式在植物光合作用中發(fā)揮作用。采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),對(duì)與ThPP1基因具有高度同源性的水稻體OsPP1基因進(jìn)行定點(diǎn)突變,共獲得4種不同突變形式的植株:A插入、3、21、47個(gè)堿基缺失。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)將水稻OsPP1基因的成功敲除為科學(xué)評(píng)價(jià)水稻無(wú)機(jī)焦磷酸化酶OsPP1基因、通過(guò)再導(dǎo)入外源同源體基因如小鹽芥ThPP1基因評(píng)價(jià)其生理生化功能提供了一條有效的方法途徑和重要的材料支持。
【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S511

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本文編號(hào)：1265700