本文關(guān)鍵詞：MDC細(xì)胞蛋白雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的建立

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【摘要】：MDCK細(xì)胞(Madin-Darby canine kidney cells)是從一只正常成年可卡犬的腎臟中分離出來(lái)的貼壁型細(xì)胞。MDCK細(xì)胞對(duì)腺病毒、犬細(xì)小病毒、呼腸孤病毒、禽流感病毒等多種病毒都比較敏感,而且細(xì)胞容易大規(guī)模培養(yǎng),增殖快,流感病毒感染效率高,可產(chǎn)生高滴度,所以MDCK細(xì)胞被納入生產(chǎn)甲型流感疫苗和乙型流感疫苗的細(xì)胞系之一。疫苗中殘留的宿主細(xì)胞蛋白會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒害作用,可能會(huì)引起過(guò)敏反應(yīng)。為了保證疫苗產(chǎn)品的安全有效,中國(guó)藥典限定了宿主細(xì)胞蛋白的殘留量,本研究對(duì)疫苗中殘留的MDCK細(xì)胞蛋白檢測(cè)方法進(jìn)行了初步的探索。先用MDCK細(xì)胞制備了蛋白含量為5.03mg/mL的MDCK細(xì)胞蛋白抗原,選用低劑量抗原短程免疫法免疫家兔、豚鼠、雞和羊四種動(dòng)物,獲得多克隆抗體。由于豚鼠血和雞血中MDCK抗體水平均過(guò)低,所以選用兔抗MDCK和羊抗MDCK多克隆抗體進(jìn)行雙抗體夾心ELISA方法的建立。然后用間接ELISA方法測(cè)定制備的抗體效價(jià),兔血中MDCK抗體水平為1:10000;羊血中MDCK抗體水平為1:1000。雙向瓊脂免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)測(cè)定制備的兔抗MDCK多克隆抗體效價(jià)為1:32,羊抗MDCK多克隆抗體效價(jià)為1:8。經(jīng)western blot分析,制備的兔抗MDCK和羊抗MDCK多克隆抗體與胎牛血清、新生牛血清、馬血清均沒有出現(xiàn)交叉反應(yīng),本試驗(yàn)制備獲得的多克隆抗體具有良好的特異性。用純化的羊抗MDCK多克隆抗體作為包被抗體,用改良過(guò)碘酸鈉法標(biāo)記的兔抗MDCK多克隆抗體作為酶標(biāo)抗體,建立檢測(cè)MDCK細(xì)胞蛋白雙抗體夾心ELISA方法,經(jīng)過(guò)對(duì)各反應(yīng)條件的優(yōu)化,最終得到最優(yōu)條件:羊抗MDCK抗體最佳包被濃度為1Oμg/mL,含10%馬血清的PBST液為最佳封閉液,酶標(biāo)兔抗MDCK抗體最佳稀釋度為1:2000。MDCK細(xì)胞蛋白含量在2.5-40μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系較好,最低檢測(cè)值為2.5μg/mL。對(duì)該方法的質(zhì)量評(píng)價(jià)驗(yàn)證結(jié)果表明,建立的雙抗體夾心ELISA方法特異性、穩(wěn)定性和重復(fù)性好。用建立的雙抗體夾心ELISA方法對(duì)基于MDCK細(xì)胞生產(chǎn)的重組禽流感病毒三價(jià)滅活疫苗(細(xì)胞源,Re-6株+Re-7株+Re-8株)進(jìn)行檢測(cè),均能檢出殘留蛋白。目前,《中國(guó)藥典》還未有關(guān)于疫苗中MDCK細(xì)胞蛋白殘留量的相關(guān)規(guī)定,本研究建立的雙抗體夾心ELISA定量檢測(cè)方法,為基于MDCK細(xì)胞生產(chǎn)人用及獸用疫苗過(guò)程監(jiān)測(cè)及產(chǎn)品檢測(cè)奠定了基礎(chǔ),為提高疫苗的質(zhì)量,降低市場(chǎng)風(fēng)險(xiǎn)提供了保障。
【學(xué)位授予單位】：西北民族大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.4

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